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| 供貨周期 | 現貨 | 規格 | 50T |
|---|---|---|---|
| 貨號 | YLK10401P | 應用領域 | 化工,生物產業 |
| 主要用途 | 科研實驗 | 保存條件 | 低溫運輸，-20℃保存 |
| 有效期 | 12個月 | 試劑盒說明 | 不同批號的試劑盒組分不可交互使用 |
人皰疹病毒 8 型探針法熒光定量PCR試劑盒
產品名稱：人皰疹病毒 8 型探針法熒光定量PCR試劑盒
英文名稱：Human Herpesvirus-8(HHV-8) Probe qPCR Kit
人皰疹病毒 8 型（Human Herpesvirus-8，HHV-8) 會引起人類的原發和繼發感染，原發感染在兒童中多見，水痘的出疹突發，常出現紅色皮疹或斑疹， 繼續發展為成串水皰、膿皰，最后結痂。病情一般較輕，但偶可并發間質性肺炎和感染后腦炎。該病毒對人體健康造成嚴重損害，因此快速檢測人皰疹病毒 8 型具有重要意義。本產品就是以探針法熒光定量 PCR 技術為基礎開發的專門檢測人皰疹病毒 8 型的試劑盒，它具有下列特點：
1. 即開即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板。
2. 引物和探針經過優化，靈敏性高。
3. 提供陽性對照，便于區分假陰性樣品。
4. 特異性高，引物是根據牛腺病毒（4-8 型）DNA 高度保守區設計，不會跟其他微生物的 DNA 發生交叉反應。
5. 既可用于定性檢測，又可用于定量檢測。用于定量檢測時線性范圍至少為 5 個數量級。
6. 本產品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 PCR 反應。
7.本產品只能用于科研。
【試劑組成】
成分 | 五孔盒包裝 |
2×Probe qPCR MagicMix | 500 μL（紅蓋） |
熒光 PCR 專用模板稀釋液 | 1 mL（綠蓋） |
超純水 | 1 mL（白蓋） |
人皰疹病毒 8 型探針法 qPCR 引物-探針混合液 | 150 μL（棕色管） |
人皰疹病毒 8 型探針法 qPCR 陽性對照(1×10E7 拷貝/μL) | 50 μL（黃蓋） |
使用手冊 | 1 份 |
【運輸及保存】低溫運輸，-20℃保存，保存期限為 12 個月。
【自備試劑】樣品RNA。
【注意事項】
一、稀釋標準曲線樣品（以 10E1-10E6 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）。由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原，本 產品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對照。
1. 標記 6 個離心管，分別為 6，5，4，3，2，1。
2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同。
3. 在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭，在 4 號管中加入 5 μL 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E4 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
6. 重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。
二、樣品 DNA 的制備
7. 如果有 N 個樣品待提取，最好設置 N+2 個提取，多出的是 PC（樣品制備陽
性對照）和 NC（樣品制備陰性對照）。可以取陽性對照的 1000 倍稀釋液10μL 再加上一定量的水，使總體積與待提取樣品的規定體積一致，以此作為 PC。另外用水作為 NC。
8. 用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數 DNA/提取試劑盒兼容。
三、Probe qPCR 反應（20μL 體系，在樣品制備室進行）
9. 如果做定量分析并且只做 1 次重復，則標記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），6 個用于標準曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復，則標記 N+4 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），1 個用于 PCR 陽性對照（用第 4 號管的陽性對照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。
10. 在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設 置完畢后才設置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好
后最后加）：
成分/每管 | 樣品管 N+2 個 | PCR 陰性 對照管 | 標準曲線 樣品管（1-6 管） |
2×Probe qPCR MagicMix | 10 μL | 10 μL | 10 μL |
人皰疹病毒 8 型探針法qPCR 引 物-探針混合液 | 3 μL | 3 μL | 3 μL |
N+2 個待測 DNA 模板 | 7 μL | - | - |
超純水 | - | 7 μL | - |
第 6 步所得標準曲線樣品稀釋液 （1-6 號） |
- |
- | 7 μL（1 號樣到 1號管，2 號樣到 2 號 管…） |
11. 蓋上蓋子后上機，按下面參數進行 PCR：
過程 | 溫度 | 時間 |
預變性 | 95℃ | 10 min |
PCR 反應 （45 個循環） | 95℃ | 15 sec |
60℃ | 60 sec（采集 FAM 通道的熒光 信號） |
四、數據處理
12. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品核酸濃度的 log 值，再推算出其濃度。
13. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大于或等于 41。陽性對照必須有熒光對數增長，有典型擴增曲線，Ct 值應該小于或等于 39。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 41 則為陰性，如果小于或等于 39 則為陽性。如果在 39-41 之間，則重復一次。重復實驗的 Ct值如果大于或等于 41 則為陰性，如果小于 41，則為陽性。
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