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供貨周期 | 現(xiàn)貨 | 規(guī)格 | 50T |
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貨號 | YLK10404P | 應(yīng)用領(lǐng)域 | 化工,生物產(chǎn)業(yè) |
主要用途 | 科研實驗 | 保存條件 | 低溫運輸,-20℃保存 |
有效期 | 12個月 | 試劑盒說明 | 不同批號的試劑盒組分不可交互使用 |
鼠疫桿菌(YP)核酸檢測試劑盒(熒光-PCR 法)
產(chǎn)品名稱:鼠疫桿菌(YP)核酸檢測試劑盒(熒光-PCR 法)
英文名稱:Yersinia Pestis Detection Kit (Real-Time PCR Method)
鼠疫是由鼠疫耶爾森氏菌(Yersinia Pestis, YP),簡稱鼠疫桿菌,引起危害人類健康的烈性傳染病之一,具有傳染性強、傳播迅速、疫情嚴重、死亡率高等特點, 為國際檢疫傳染病。
本試劑盒適用于檢測動物腺、肝、脾、肺組織及人痰、血液等標本中分離出的鼠疫桿菌,用于鼠疫桿菌的輔助診斷。
本試劑盒采對鼠疫桿菌基因設(shè)計特異性的引物和探針,用熒光 PCR 技術(shù)對鼠疫桿菌的核酸進行體外擴增檢測,用于臨床上對可疑感染者的病原學(xué)診斷。
【試劑組成】
名 稱 | 規(guī) 格 |
酶液 | 50μL×1 管 |
YP 反應(yīng)液 | 1.0mL×1 管 |
YP 陽性質(zhì)控品 | 50μL×1 管 |
陰性質(zhì)控品 | 250μL×1 管 |
說明:不同批號的試劑盒組分不可交互使用。
【運輸及保存】
-20℃±5℃,避光保存、運輸、反復(fù)凍融次數(shù)不超過 5 次,有效期 12 個月。
【適用儀器】
ABI 、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。
【注意事項】
1. 樣品處理(樣本處理區(qū))
1.1 樣本前處理
組織樣品:稱取組織樣品約 0.5g,置于研磨器中研磨,加入 1.5mL 生理鹽水后繼續(xù)研磨,勻漿后取 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中;
痰、尿液等液體樣品:取 100μL 于滅菌離心管中;
血液樣品:取抗凝血下層血細胞 50μL,加入 100μL 雙蒸水吹勻。
1.2 DNA 提取
1) 對上述處理好的標本加入 50μL 核酸提取液,100℃恒溫處理 10min,13,000
rpm 離心 5min,取上清液轉(zhuǎn)移至新的 1.5mL EP 管,-20℃保存;
2) DNA 的提取也可以采用我公司生產(chǎn)的 DNA/提取試劑盒
(離心柱提取法),請嚴格按照試劑盒說明書進行操作。
2. 試劑配制(試劑準備區(qū))
根據(jù)待檢測樣本總數(shù),設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對照+1 管陽性對照;樣品每滿 7 份,多配制 1 份),每測試反應(yīng)體系配制如下表:
試劑 | YP 反應(yīng)液 | 酶液 |
用量(樣本數(shù)為 N) | 20μL | 1μL |
將混合好的測試反應(yīng)液分裝到 PCR 反應(yīng)管中,21uL/管。
3. 加樣(樣本處理區(qū))
將步驟 1 提取的 DNA、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 4μL,分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中,蓋好管蓋,混勻,短暫離心。
4. PCR 擴增(核酸擴增區(qū))
4.1 將待檢測反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi);
4.2 設(shè)置好通道、樣品信息,反應(yīng)體系設(shè)置為 25μL;
熒光通道選擇: 檢測通道(Reporter Dye)FAM, 淬滅通道(Quencher Dye)
NONE,請勿選擇 ROX 參比熒光。
1.1 推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置:
步驟 | 循環(huán)數(shù) | 溫度 | 時間 | 收集熒光信號 |
1 | 1 cycle | 95℃ | 10min | 否 |
2 | 40 cycles | 94℃ | 15sec | 否 |
55℃ | 30sec | 是 |
2. 結(jié)果分析判定
2.1 結(jié)果分析條件設(shè)定
設(shè)置 Baseline 和 Threshold:一般直接按機器自動分析的結(jié)果分析,當(dāng)曲線出現(xiàn)整體傾斜時,根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、stop 值(一般可在 5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié)),以及 Threshold 的 Value 值(上下拖動閾值線至高于陰性對照),重新分析結(jié)果。
2.2 結(jié)果判斷
陽性:檢測通道 Ct 值≤35.0,且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線。
可疑:檢測通道 Ct 值>35.0,且出現(xiàn)明顯擴增曲線的樣本建議重復(fù)試驗,重復(fù)試驗結(jié)果出現(xiàn) Ct 值≤35.0 和明顯擴增曲線者為陽性,否則為陰性。
陰性:樣本檢測結(jié)果無 Ct 值且無明顯的擴增曲線。
3. 檢測方法的局限性
? 樣本檢測結(jié)果不樣本收集、處理、運送以及保存質(zhì)量有關(guān);
? 樣本提取過程中沒有控制好交叉污染,會出現(xiàn)假陽性結(jié)果;
? 陽性對照、擴增產(chǎn)物泄漏,會導(dǎo)致假陽性結(jié)果;
? 病原體在流行過程中基因突變、重組,會導(dǎo)致假陰性結(jié)果;
? 不同的提取方法存在提取效率差異,會導(dǎo)致假陰性結(jié)果;
? 試劑運輸,保存不當(dāng)或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降,出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準確的結(jié)果。
4. 質(zhì)控標準
陰性質(zhì)控品:無明顯擴增曲線或無 Ct 值顯示;
陽性質(zhì)控品:擴增曲線有明顯指數(shù)生長期,且 Ct 值≤32; 以上條件應(yīng)同時滿足,否則實驗視為無效。
【注意事項】
? 所有操作嚴格按照說明書進行;
? 試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化,wan全混勻并短暫離心;
? 反應(yīng)液應(yīng)避光保存;
? 反應(yīng)中盡量避免氣泡存在,管蓋需蓋緊;
? 使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)與用工作服;
? 樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進行,以免交叉污染;
? 實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器;
? 試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對待,并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實驗室生物安全通則》進行處理。
【參考文獻】
[1] 國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局.SN/T 1280-2003 國境口岸鼠疫檢驗規(guī)程[S].北京:科學(xué)出版社, 2003.
[2] 張志凱, 海榮, 蔡虹, 等. 鼠疫耶爾森菌的多重 PCR 檢測方法[J]. 中國媒介生物學(xué)及控制雜志, 2007.
[3] 吉林省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局. DB22/T 2081-2014 鼠疫耶爾森菌核酸的測定-熒光PCR 方法[S].