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更新時(shí)間:2024-07-18 15:10:45瀏覽次數(shù):366評(píng)價(jià)
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供貨周期 | 現(xiàn)貨 | 規(guī)格 | 50T |
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貨號(hào) | YLK10414P | 應(yīng)用領(lǐng)域 | 化工,生物產(chǎn)業(yè) |
主要用途 | 科研實(shí)驗(yàn) | 保存條件 | 低溫運(yùn)輸,-20℃保存 |
有效期 | 12個(gè)月 | 試劑盒說(shuō)明 | 不同批號(hào)的試劑盒組分不可交互使用 |
豬日本乙型腦炎病毒熒光定量RT-PCR試劑盒
產(chǎn)品名稱:豬日本乙型腦炎病毒熒光定量RT-PCR試劑盒
英文名稱:Epidemic Encephalitis B SYBR qRT-PCR Kit
乙型腦炎病毒(Epidemic Encephalitis B)是一種 RNA 病毒,也是豬日本乙型腦炎(流行性乙型腦炎)的病原體,在低溫條件下,該病毒能自下而上較長(zhǎng)時(shí)間,在動(dòng)物、雞胚及組織培養(yǎng)細(xì)胞中均能增殖。幼豬是乙腦病毒的主要傳染源和中間宿主,蚊子是乙腦 病毒的傳播媒介。當(dāng)人受帶病毒的蚊子叮咬后,乙腦病毒進(jìn)入人體,在血管內(nèi)皮 細(xì)胞、淋巴結(jié)、肝、脾等吞噬細(xì)胞內(nèi)增殖,并經(jīng)血液循環(huán)到達(dá)腦部而引起炎癥, 因此乙型腦炎病毒的快速準(zhǔn)確鑒定對(duì)該病的預(yù)防和檢疫有著重要作用。本產(chǎn)品基于 PCR 原理開(kāi)發(fā)。它具有下列特點(diǎn):
1. 一站式,用于不需要單獨(dú)準(zhǔn)備每種成分,包括引物和對(duì)照。
2. 根據(jù)乙型腦炎病毒的保守基因序列設(shè)計(jì)的引物,具有良好的特異性。
3. 基于染料法 qRT-PCR 檢測(cè),靈敏度比常規(guī) RT-PCR 高 10-100 倍,可以達(dá)到至少 1000 拷貝/反應(yīng)。
4. 使用一管式 qRT-PCR 技術(shù),RT 和 PCR 兩步在一個(gè)試管內(nèi)完成,不需要中間轉(zhuǎn)移樣品,降低了操作誤差和可能的污染。
5.本產(chǎn)品足夠 50 次 30μL 體系的 RT-PCR,只能用于科研,不能用于臨床。
【試劑組成】
成 份 | 包裝 |
2×qRT-PCR 緩沖液 | 500 μL(棕色管) |
10×qRT-PCR 酶混合液 | 100 μL(紅蓋) |
ROX 染料 I,50× | 20 μL(棕色管) |
ROX 染料 II,50× | 20 μL(棕色管) |
熒光 PCR 專用模板稀釋液 | 1mL(亮黃蓋) |
乙型腦炎病毒 qRT-PCR 引物混合液 | 100 μL(白蓋) |
乙型腦炎病毒 qRT-PCR 陽(yáng)性對(duì)照 (1×10E8 拷貝/μL) | 50 μL(黃蓋) |
核酸釋放劑 | 1mL(綠蓋) |
使用手冊(cè) | 1 份 |
【運(yùn)輸及保存】
低溫運(yùn)輸,-20℃保存,保存期限為 12 個(gè)月。陽(yáng)性對(duì)照需要因易污染其他成分需要單獨(dú)放置。本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽(yáng)性對(duì)照,只提供 RNA 片段作為陽(yáng)性對(duì)照
【自備試劑】樣品 RNA
【注意事項(xiàng)】
一、稀釋陽(yáng)性對(duì)照(以 10E2-10E7 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高,因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行)。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原。
1.標(biāo)記 6 個(gè)離心管,分別為 7,6,5,4,3,2。用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液,最好用帶芯槍頭,下同)。
2.在 7 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(本試劑盒提供),充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E7 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。
3.換槍頭,在 6 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得),充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E6 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。
4.換槍頭,在 5 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得),充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E5 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。
二、樣品 RNA 的制備
5.如果有 N 個(gè)樣品,必須設(shè)置 N+2 個(gè)提取,多出的一個(gè)是 PC(樣品制備陽(yáng)性對(duì)照),一個(gè)是 NC(樣品制備陰性對(duì)照)。可以用 10μL 上步制備的陽(yáng)性對(duì)照梯度稀釋液中的第 4 號(hào)(濃度為 1×10E4 拷貝/μL,10μL 相當(dāng)于 1 萬(wàn)拷貝)再加上一定量的水作為制備的陽(yáng)性對(duì)照(加水后其總體積跟樣品一樣,樣品體積多少取決于所用試劑盒的要求)。可以用水作為制備的陰性對(duì)照。
6.用自選方法純化 N+2 個(gè)樣品的 RNA,本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)病毒 RNA/提取試劑盒兼容。本試劑盒免費(fèi)贈(zèng)送1ml免 RNA 提取的核酸釋放劑,其使用手冊(cè)可以向本公司客服索取。
三、設(shè)置 RT-PCR 反應(yīng)(20μL 體系,在樣品制備室進(jìn)行)
7.如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù),則標(biāo)記 N+9 個(gè) PCR 管,其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品,1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照,6 個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析,并且只做 1 次重復(fù),則標(biāo)記 N+4 個(gè) PCR 管,其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品,1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照(用水做模板),1 個(gè)用于 PCR 陽(yáng)性對(duì)照(用第 4 號(hào)陽(yáng)性對(duì)照稀釋液做模板)。下面只描述定量分析的步驟,定性分析只是把 6 個(gè)標(biāo)曲反應(yīng)縮減成 1 個(gè),其余不變。
8.在標(biāo)記管中按下表加入各成分(本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對(duì)照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照,陽(yáng)性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子后最后加):
成分 | N+2 個(gè)制備 所得樣品 | RT-PCR 陰性對(duì)照 | RT-PCR 陽(yáng)性 對(duì)照(2-7 管) |
2×qRT-PCR 緩沖液 | 10μL | 10μL | 各 10μL |
乙型腦炎病毒 qRT-PCR 引物混合物 | 2μL | 2μL | 各 2μL |
50×ROX (見(jiàn)注) | 0.4μL | 0.4μL | 各 0.4μL |
樣品制備所得 RNA 模板 (來(lái)于第 8 步) | 5.6μL | 不加 | 不加 |
稀釋所得 6 個(gè)陽(yáng)性對(duì)照 (來(lái)于第 6 步) |
不加 |
不加 | 各 5.6μL(2 號(hào)樣 到 2 號(hào)管,3 號(hào)樣到 3 號(hào)管…) |
10×qRT-PCR 酶混合液 | 2μL | 2μL | 2μL |
注:需使用 ROX 染料 I 的機(jī)型:ABI Prism7000、7300、7700、7900HT、Step-One、Step-One Plus。
需使用 ROX 染料 II 的機(jī)型::ABI Prism 7500、7500Fast、MJ Research 的 Chromo4、Opticon(II)Corbett Rotor Gene 3000。
不 需 要 使 用 ROX 的 機(jī) 型 : Thermal Cycle Dice Real Time System , LightCycler、Smart Cycler System、Agilent Mx3000P、RotorGene 3000、RotorGene 6000。
9. 上機(jī)后按下面參數(shù)進(jìn)行 RT-PCR(參數(shù)可能會(huì)因儀器不同而需優(yōu)化)。
過(guò)程 | 溫度 | 時(shí)間 |
RT(逆轉(zhuǎn)錄) | 50℃ | 2min |
預(yù)變性 | 95℃ | 10min |
RT - PCR 反應(yīng) (40 個(gè)循環(huán)) | 95℃ | 15 sec |
60℃ | 1 min(采集 FAM 通道的熒光信號(hào)) | |
按儀器預(yù)設(shè)程序進(jìn)行熔解曲線分析 |
四、數(shù)據(jù)處理
10.如果把本試劑盒用于定量檢測(cè),則以陽(yáng)性對(duì)照濃度的 log 值為橫軸,以 Ct 值為縱軸,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測(cè)樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 RNA 濃度的 log 值,再推算出其濃度。
如果把本試劑盒用于定性檢測(cè),只判斷陽(yáng)性或陰性,則陰性對(duì)照 Ct 必須大于或等于 40。陽(yáng)性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng),有典型擴(kuò)增曲線,Ct 值應(yīng)該小于或等于 30。對(duì)待測(cè)樣品,如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性,如果小于或等于 35 則為陽(yáng)性。如果在 35-40 之間,則重復(fù)一次。
(空格分隔,最多3個(gè),單個(gè)標(biāo)簽最多10個(gè)字符)