免疫熒光染色技術是一種以免疫學為基礎，結合生物化學技術和顯微技術發展而來的蛋白等分子檢測技術。那么你知道影響免疫熒光（IF）實驗結果的因素有哪些嗎？讓我們一起來看看吧！
一、免疫熒光染色方法的選擇
免疫熒光染色技術分為直接法和間接法。
直接法：將熒光標記物偶聯在抗原/抗體上，直接與相應的抗體/抗原反應。
間接法：先用未標記的一抗與抗原充分反應后，再利用熒光標記的二抗與已經結合在抗原上的一抗結合，達到檢測抗原的目的。
優點 | 缺點 | |
直接法 | 操作簡單、特異性高，非特異性染色少便于相同宿主來源的不同蛋白的共定位 | 靈敏性相對比間接法低 |
間接法 | 靈敏度高，染色更加靈活，成本低。 | 相對直接法操作復雜 |
二、抗體的選擇
與目標蛋白直接結合的一抗，在條件允許的條件下，盡量選擇相同來源的免疫原或者選擇已驗證種屬反應性的抗體。
如果進行不同目標蛋白的雙染或多染時，這些不同蛋白所對應的一抗應該來源于不同宿主。
優點 | 缺點 | |
單克隆抗體 | 特異性高 | 靈敏度相對較低，制備過程復雜，價格也相對較高 |
多克隆抗體 | 制備過程簡單，周期短，價格相對較低，靈敏度更高，對于表達量較低的目標蛋白更容易檢出。 | 特異性相對較低 |
單克隆抗體與多克隆抗體、種屬免疫原、反應性和抗體的宿主來源是抗體選擇最主要考慮的因素，其直接決定著免疫熒光染色的背景、特異性和成敗。熒光偶聯的二抗應選擇與一抗相對應的抗體，及抗一抗的二抗。
三、抗體保存
防止熒光抗體失活、污染以及熒光染料的脫落和淬滅。
在抗體保存過程中，適量分裝，避免反復凍融。
蛋白極易被塑料等吸附，如果用塑料管分裝，抗體中應添加BSA等。
為防止污染也可以添加0.01%的硫柳汞或者0.1%的die氮化鈉。
為防止淬滅，保存熒光抗體時應該注意避光，可以利用錫箔紙包好，或者放在避光的容器中。
四、培養載體的選擇
根據貼壁情況，細胞可分為貼壁細胞和懸浮細胞。
貼壁細胞一般常用24孔細胞培養板培養，接種細胞前放置0.17mm玻璃細胞爬片。
懸浮細胞常用6孔板培養，免疫熒光染色處理后，取少量加在0.17mm玻璃細胞爬片上。
最后將細胞爬片倒扣到載玻片上，封片，放4℃保存。
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