免疫組化技術(shù)是利用已知的特異性抗體或抗原能特異性結(jié)合的特點(diǎn)，通過(guò)化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記于結(jié)合后的特異性抗體上的顯示劑通過(guò)借助顯微鏡的觀察，從而在抗原抗體結(jié)合部位確定組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)的一門組化技術(shù)。那么影響免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果的因素有哪些呢？讓我們一起來(lái)看看吧！
一、組織的固定
組織固定的好壞直接影響免疫組化的結(jié)果，選擇良好的固定液并及時(shí)充分的固定可以防止組織自溶，最大限度保留組織的抗原性，保證免疫組化結(jié)果的準(zhǔn)確性。
常用固定液：
10%的中性緩沖福爾馬林（40%甲醛10ml+0.01mol/LPBS90ml(pH7.4)），一般固定液的量為組織塊體積的4~10倍，固定時(shí)間（常溫條件下固定8~24h）。
二、組織的脫水
組織脫水不che底，會(huì)出現(xiàn)組織掉片的現(xiàn)象，而且顯色效果差，容易混淆診斷。
為保證組織脫水che底，應(yīng)制定相應(yīng)的更換試劑的制度，及時(shí)更換并有專人負(fù)責(zé)，做好相應(yīng)的記錄。
三、切片
玻片選擇粘附載玻片，切片不宜厚，推薦厚度3~5μm，可以保證后續(xù)修復(fù)時(shí)最大限度暴露抗原。切片無(wú)皺褶、無(wú)氣泡，烤片溫度設(shè)置65~68℃，時(shí)間為3小時(shí)?？酒怀浞謺?huì)導(dǎo)致組織脫片影響后續(xù)的檢測(cè)，但烤片也不宜過(guò)度，溫度過(guò)高會(huì)加速抗原氧化，導(dǎo)致抗原丟失。
四、阻斷內(nèi)源酶
進(jìn)行免疫組化標(biāo)記的組織，通常含有一定量的內(nèi)源性酶，由于在免疫組化染色過(guò)程中，大部分抗體是用過(guò)氧化物酶來(lái)標(biāo)記的。
比如我們通常使用HRP即辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，酶起催化作用，促進(jìn)底物的結(jié)合，而組織中的內(nèi)源性酶同樣也能催化底物，這就影響了免疫組化的特異性。所以在加酶標(biāo)二抗之前，應(yīng)先用過(guò)氧化氫阻斷內(nèi)源酶，將對(duì)后續(xù)檢測(cè)結(jié)果的影響降到zui低。
五、抗體的選擇和使用
選用與使用的一抗同源性的二抗。要選擇適宜的一抗，不同的二抗與一抗?jié)舛炔黄ヅ?，都不能得到滿意的結(jié)果。
在滴加一抗、二抗時(shí)要先輕輕傾去PBS液，選用韌性好、吸水性強(qiáng)的紙巾吸干組織周圍液體，輕壓組織面吸干組織表面水分(不能滑動(dòng))，防止試劑被稀釋或致濃度不均，立即滴加適量試劑，用細(xì)玻棒將試劑擴(kuò)展至組織外1～2mm，防止出現(xiàn)邊緣效應(yīng)，不能觸碰組織，液面厚約1mm為宜。
一抗孵育溫度一般設(shè)置37℃1小時(shí)或者4℃冰箱孵育過(guò)夜，二抗室溫孵育30-60min。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，推薦在實(shí)驗(yàn)中設(shè)置同片的陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。
試劑表面的氣泡用玻棒點(diǎn)破，否則氣泡張力作用會(huì)導(dǎo)致局部無(wú)試劑，出現(xiàn)氣泡下假陰性反應(yīng)。
六、顯色反應(yīng)
DAB顯色劑須現(xiàn)配現(xiàn)用，切片多時(shí)應(yīng)分次配制，分批顯色。根據(jù)溫度和整體顯色情況決定終止反應(yīng)，一般顯色時(shí)間3～5min，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)致顯色過(guò)深和背景著色，過(guò)短致反應(yīng)不足或出現(xiàn)假陰性。
由于DAB有一定的毒性，在操作時(shí)要特別注意自身的防護(hù)，實(shí)驗(yàn)器材專用，以防污染。
七、試劑的保存
因?yàn)榭贵w是蛋白質(zhì)，保存或使用不當(dāng)不但會(huì)造成浪費(fèi)，而且變質(zhì)會(huì)出現(xiàn)假陰性結(jié)果。
要注意抗體的有效期，對(duì)于一次用不完的抗體可保存在冰箱內(nèi)，而不要放在冷凍室，反復(fù)凍融，抗體效價(jià)會(huì)急劇下降而失效。
同時(shí)防止抗體的相互交叉污染和細(xì)菌污染。
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