小奧課堂又來啦！

這一次干貨滿滿喲，

快來看看ELISA在生物藥研發中的直接法實驗方案吧！

一、前言

ELISA在生物藥物研發的各個環節均有廣泛的應用：

如以生物大分子檢測為目的，在藥效藥代評估時，對動物實驗和臨床實驗中的血液樣品的藥物濃度和生物大分子標志物進行定量檢測；

以親和力測定為目的，在質量分析過程中，對抗體相對于靶點抗原的親和力檢測；

以親和力篩選為目的，在抗體發現過程中，對雜交瘤細胞克隆上清分泌抗體相對于靶點抗原的親和力大小進行區分等。

使用目的不同，則需要選取不同特性試劑耗材。

參差多態方顯世界精彩，ELISA方法學開發也是一個道理。

本篇為ELISA方法開發構建的的幾大實例之一——生物大分子檢測的定量方法開發的具體實驗方案，適用于所有初接觸ELISA方法技術且有志于進行ELISA方法開發建立的同仁。

有多精彩，且往下看：

二、ELISA定量方法的類型和構架

采用ELISA技術進行定量的平臺化方法——一般來說可以分為兩類，即間接法和直接法。

間接法也稱為競爭法，直接法也稱雙抗夾心法。

今天，我們重點為大家介紹直接法。

直接法以定量抗原為例：

首先，以與抗原有強親和力的抗體包被固定在酶標板材上，加入抗原標準品/樣品反應，再加入與抗原有強親和力的抗體并且偶聯了辣根過氧化氫酶HRP/堿性磷酸酶AP的酶聯抗體反應，后加入酶對應的底物顯色，中間通過洗滌去除反應體系中未結上的試劑成分。

這樣信號大小和抗原的濃度成正相關，隨著反應的進行酶標板材上固定的成分由抗體，轉變為抗體-抗原，后變為抗體-抗原-酶聯抗體，待測的抗原處于兩個抗體之間，所以也稱為雙抗夾心法。

雙抗夾心法有一個關鍵點：待檢測的物質（如抗原）必須給包被抗體和酶聯抗體提供兩個結合位點，這兩個位點可以是抗原上兩個以上相同的結構位點，也可以是不同的結構位點。

一般來說，Elisa的構架由標準品，內控品，對照，基質對照和待測樣品組成。

 標準品 

根據實驗的具體應用方向來源，標準品可以是已知濃度的/國家標準品或者商業化的已知濃度的蛋白分子，也可以是自制的以其他方式定量（如紫外吸收定量）的純度較高的蛋白分子。標準品一般為7-8個濃度點，擬合成合適的濃度-信號劑量曲線作為標準曲線進行內控品和樣品的定量。

 內控品 

其中，內控品是能夠使用的、獨立分裝的、特定濃度（高中低）的標準品，是監控ELISA實驗在單次實驗中的質量和的應用過程中不同批次標準品的過渡橋接。

 對照 

對照為不含標準品的標準品溶液，基質對照則為不含樣品的樣品溶液——兩者可能是一樣的成分，也可能是不同的成分，需要根據實驗的具體情況進行區分，目的是確認ELISA體系中是否有非異的交叉反應。

三、ELISA實驗：你的耗材試劑選對了嗎？

成功的ELISA方法的開發關鍵，在于對ELISA實驗中所使用的試劑耗材的選擇和搭配。

對試劑耗材的特性和多樣性的了解，有助于在不同的實驗需求中尋找合適的組合搭配中開發高質量的ELISA方法。

①酶標板材：

市面上提供的酶標板材基本都是多聚苯乙烯，產品線比較齊全的公司會對多聚苯乙烯材質的多種化學修飾以相對于包被的蛋白具有不同的特性。

一般的酶標板材的說明書上會根據高結合力（Highbinding），中結合力（mediumbinding）的維度進行劃分。

但筆者以多年的從業經驗出發，會更信任以親水，弱親水，未處理和疏水四個等級劃分酶標板材的類型和特性的酶標板材。

一般來說，酶標板材由親水到疏水，對蛋白的結合會由強逐漸變弱，這會帶來三個效果：

相同濃度的蛋白包被，結合能力強的比結合能力弱的材料可以在酶標板材上固定更多的蛋白，因為單孔親水板材的吸附抗體量是220ng，而疏水板材只有100ng。

由親水到疏水，板材對包被蛋白的吸附效率提高的同時，其對ELISA反應過程中樣品蛋白、樣品溶液中的其他蛋白和酶聯抗體的非特異吸附的能力也會提高，從而造成非特異信號。

包被的蛋白作為一個大分子以一個表面吸附在酶標板材上，其表面在不同酶標板材上并不是大多數人想象中的隨機均勻的，有明顯的偏向性，會導致在不同的特性酶標板材上，包被蛋白與酶標板材的接觸表面不一樣，從而造成不同的位點被屏蔽的現象。如果這個位點恰好是與檢測樣品結合的位點，樣品將會因此無法被檢測到。

所以一個專注多樣化ELISA方法開發的實驗室應該準備多種不同特性的酶標板材以供選擇。

②包被液：

常用的包被液是PBS（pH 7.4）或者碳酸鈉-碳酸氫鈉溶液pH 9.6，pH和離子濃度會對包被的效率產生一定的影響，需根據包被蛋白的特性進行具體分析，包被蛋白溶液經過包被后也不會都吸附在酶標板材上，包被完成后大部分蛋白還是留在溶液中。

文獻中有記載蛋白溶于包被液后抽真空使包被蛋白以更高的密度吸附在酶標板材上的案例。

③封閉劑：常用的封閉劑有3%BSA（w/v），5%脫脂奶粉（w/v）等。

封閉液的作用是覆蓋酶標板材包被蛋白占據位置以外的空間，以抵抗后續樣品或者樣品中的其他物質、酶聯抗體等對于板材直接的非特異吸附。

根據筆者多年的實踐經驗，封閉劑只能對成分簡單的樣品溶液起到較好的封閉作用但面對成分比較復雜的樣品溶液，封閉效果則會大打折扣。

有研究表明，封閉劑的封閉效果和封閉分子的大小成反比，所以如果傳統的封閉劑起不到很好的封閉效果，選用分子量更小的封閉劑（如：酪蛋白），可能會取得更好的封閉效果。

另外需特別注意：如果檢測體系是生物素-鏈霉親和素體系，千萬不要使用脫脂奶粉作為封閉劑——因為脫脂奶粉中含有生物素，會對檢測體系造成干擾。

④洗滌液/稀釋液：

常用的洗滌液是中性的緩沖液加上一定濃度的去污劑如PBST (0.05%(V/V) Tween-20 in PBS)。

稀釋液會在洗滌液中加入一定的封閉劑成分如0.5%BSA (W/V ) in PBST。

在一些體內樣品的檢測過程中，通常會在稀釋液中加入一定濃度的陰性血清，以使得不同稀釋度的樣品有相同的非特異背景。

⑤酶聯抗體：

酶聯抗體的種類很多，可根據抗體的作用位點分為特異性酶聯抗體和通用型酶聯抗體。

特異性酶聯抗體作用于特定蛋白的表位上。

通用型酶聯抗體則往往針對于多肽序列組成的標簽，生物素，特定種屬抗體的Fc端保守區域等。

常用的酶聯抗體標記的酶主要為AP（堿性磷酸酶）和HRP（辣根過氧化氫酶）。

酶聯抗體根據其抗體的成分可分為單抗酶聯抗體和多抗酶聯抗體。

其中多抗酶聯抗體的多抗成分一般是通過免疫兔或者山羊得到的，成分比較復雜，需格外注意其與ELISA體系中其他試劑的交叉反應。

酶聯抗體根據其抗體的分子量由大到小可分為全長的酶聯抗體、Fab片段酶聯抗體、scFv酶聯抗體。

分子量越小的酶聯抗體越有可能避免和樣品蛋白結合時可能存在的作用位點被空間阻礙的情況，但也進一步增加了酶聯抗體繞過封閉劑的阻斷與酶標板材進行非特異結合的風險。

⑥顯色液和酶標儀：

顯色液的選擇需與酶聯抗體的酶對應，也需和實驗室所具備的酶標儀對應。

如酶聯抗體偶聯的是HRP（辣根過氧化氫酶），可以采用TMB顯色液，用能夠進行吸光度讀數的酶標儀進行檢測；

或者Ampliflu™Red為底物，用能夠進行熒光讀數的酶標儀進行檢測；亦或采用QuantaRedADHP為底物，用能夠進行化學發光讀數的酶標儀進行檢測。

一般來說，ELISA方法的靈敏度會受到底物的檢測方法限制，化學發光底物能夠檢測的信號下限要優于熒光底物，再優于吸光度值底物。

即使是常用的TMB顯色液，很多供應商不同顯色強度的顯色液，可以根據方法開發過程的具體情況合理選擇顯色液。

四、ELISA定量方法學開發實際案例分析

布局

布局說明

增加了未包被（灰色）的分組，此分組是很有必要的，目的是為了確認待檢測的樣品或者對照品物質對酶標板材的非特異吸附。

樣品進行低中高稀釋，用來檢測樣品相對于對照品的平行性，即樣品和對照品在相同的ELISA體系中是否具備相同的免疫學特性。

如果低中高樣品的信號值在標準曲線合理的定量范圍內，低中高樣品經稀釋倍數校正后的三組濃度值接近，說明樣品和對照品平行性較好，平行性較差則該樣品的檢測不能用該對照品作為標準曲線。

一般操作流程

01

酶標板的制備：取濃度為100 ug/ml抗體，室溫溶解，混勻用包被液按如下步驟稀釋至5ug/ml，按加樣布局表加入100ml/孔，分別加入酶標板條中 (Note 1)，其中加入包被液做包被抗體的對照，2-8℃過夜。

02

用洗滌液洗板3次，拍干，加入300ml/孔封閉液(Note 2)室溫封閉1小時；洗滌液洗板3次，拍干待用；

03

抗體對照品的梯度稀釋和樣品的高中低稀釋（Note 3），100ul/孔加入微孔板中標準品稀釋。

04

放入奧豪斯微孔板振蕩器內，設置37℃、600rpm振蕩1小時；

05

用洗滌液洗板3次，拍干；

06

酶聯抗體稀釋到合適的濃度（Note 4），在奧豪斯漩渦混合器上混勻，100ul/孔。

07

放入微孔板振蕩器內，設置37℃、600rpm振蕩1小時；    

08

用洗滌液洗板4次，拍干；

09

取酶聯抗體對應的顯色液，臨用前20分鐘拿出平衡到室溫，在漩渦混合器上混勻；

10

使用8道排槍以100 ml/孔加入顯色液；

11

顯色液室溫避光放置10-30分鐘（Note 5）

12

使用8道排槍以100ml/孔加入終止液終止反應；（根據底物的不同，此步可能不需要）

13

用酶標儀測定信號值；（Note 6）

14

結果分析（Note 7）

貼心的Note說明-經驗總結

Note1：在包被過程中如果需要減少整個ELISA體系試劑對酶標板材的非特異吸附，建議選擇疏水性酶標板材（polysorp）,包被的抗體濃度要足量2-5ug/ul。

Note2：封閉液不一定能起到封閉效果，需要實驗驗證（未包被抗原的分組），一般來講分子量越小的封閉劑效果越佳。

Note3：在方法學開發的初期可以拉大一下標準曲線的濃度范圍1000ng/ml-0.1ng/ml。

Note4：酶聯抗體的稀釋需要做不同的稀釋度進行比較選擇，對于單抗成分的酶聯抗體如果高低兩個稀釋度的酶聯抗體能夠產生一樣的劑量曲線，說明酶聯抗體過量，ELISA的信號傳遞未產生偏差。對于多抗成分的酶聯抗體，其稀釋度的判斷較為復雜，可以根據標準曲線的濃度時的回測來判斷酶聯抗體濃度是否合適，如果對照品較高濃度的兩個點信號值接近，說明多抗酶聯抗體的濃度過低。

Note 5：對于吸光度值底物和熒光底物，儀器檢測的信號值和顯色時間成正比，控制在10-30分鐘為宜。需要提前確認檢測儀器的信號線性范圍，比如一般的酶標儀吸光度值的信號線性范圍在0-3，吸光度值在3-4之間為非線性的，在顯色時應控制信號值不要超過3，或者將信號值大于3的點不列入標準曲線的擬合。

Note 6：不同底物需要用不同的儀器進行檢測，吸光度讀值，熒光讀值，化學發光讀值。在底物選擇過程中注意實驗室的酶標儀是否具備該種類型的讀數功能。

Note 7：標準曲線的劑量曲線擬合可以是線性的，對數線性或者四參數擬合，檢驗標準是標準曲線各濃度點的回測偏差小于20%，如果不符合，刪除濃度點，直至符合標準。

五、總結

儀器的檢測信號的線性范圍是有限的，如TMB顯色液的信號的線性范圍在0-3，ELISA方法開發和優化過程更多時候是對于對照品的信號值的控制和調整，以使得信號值在線性范圍內。

使用增強型的TMB顯色，延長顯色時間，增加標準曲線的濃度點，增加酶聯抗體的濃度等增強信號值，反之能夠降低信號值。

在信號值的線性范圍有限的情況下，盡可能的消除非特異吸附的信號值是方法靈敏的關鍵之一，選用疏水性酶標板材，采用分子量更小的封閉劑，采用相對簡單單抗酶聯抗體或者鏈霉親和素酶聯抗體等都是有效消除非特異吸附信號的形式。

在ELISA方法學開發過程中多樣化的試劑耗材的合理選擇和搭配是一個穩定，靈敏的ELISA方法的關鍵，而多樣化試劑材料的特性的了解是選擇的關鍵，這個需要在對比實驗中根據信號的變化系統的去了解和剖析。

 - 參考資料 - 

1. ELISA技術應用概覽和方法學開發初析

有助于宏觀把握ELISA定量方法開發的原理

2. Decker J , Reischl U , Butler J E . SolidSupports in Enzyme-Linked Immunosorbent Assay and Other Solid-PhaseImmunoassays[M]// Molecular Diagnosis of Infectious Diseases. Humana Press,2004.

非常有用的ELISA綜述，有利于了解ELISA的各個環節。

3. Desilva B , Smith W , Weiner R , et al. Recommendations forthe Bioanalytical Method Validation of Ligand-Binding Assays to SupportPharmacokinetic Assessments of Macromolecules[J]. Pharmaceutical Research(Dordrecht), 2003, 20(11):1885-1900.

ELISA定量方法系統的方法學驗證過程介紹，有助于對ELISA方法的優劣進行評估

4.  Findlay J W A , Dillard R F . Appropriate calibration curvefitting in ligand binding assays[J]. Aaps Journal, 2007, 9(2):E260-E267.

ELISA標準曲線不同函數進行擬合的比較文章。

5. Cox K L , Devanarayan V , Kriauciunas A , et al. ImmunoassayMethods[J]. 2012.

類似此篇文章的英文實驗手冊，可以借鑒學習下。

6. Pillutla R C . Book review: ligand-binding assays:development, validation and implementation in the drug development arena.[J].Bioanalysis, 2011, 3(3):271-273.

非常有用關于ELISA定量方法（ligand-binding assay）各個方面的書籍，有利于加深學習。