檢測原理

試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。往預先包被 固氮酶（Nitrogenase）抗體的包被微孔中，依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體，經(jīng)過溫育并*洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的 固氮酶（Nitrogenase）呈正相關。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值），計算樣品活性。

樣品收集、處理及保存方法

1.  樣本不能含疊氮鈉（NaN3），因為疊氮鈉（NaN3）是辣根過氧化物酶（HRP）的抑制劑。

2.  標本采集后盡早進行提取，提取按相關文獻進行。

3.  土壤萃取液或其它相關樣本：請1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測。

4.  保存：如果樣本收集后不及時檢測，請按一次用量分裝，凍存

于-20℃，避免反復凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

自備物品

1. 酶標儀（450nm）

2. 高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3. 37℃恒溫箱

操作注意事項

1.  試劑盒保存在2-8℃，使用前室溫平衡20分鐘。從冰箱取出的濃縮洗滌液會有結晶，這屬于正常現(xiàn)象，水浴加熱使結晶*溶解后再使用。

2.  實驗中不用的板條應立即放回自封袋中，密封（低溫干燥）保存。

3.  濃度為0的S0號標準品即可視為陰性對照或者空白；按照說明書操作時樣本已經(jīng)稀釋5倍，最終結果乘以5才是樣本實際濃度。

4.  嚴格按照說明書中標明的時間、加液量及順序進行溫育操作。

5.  所有液體組分使用前充分搖勻。

試劑盒組成

注：標準品（S0-S5）濃度依次為：0、15、30、60、120、240 U/L

試劑的準備

 20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋，即1份的20×洗滌緩沖液加19份的蒸餾水。

洗板方法

1.  手工洗板：甩盡孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，靜置1min后甩盡孔內(nèi)液體，在吸水紙上拍干，如此洗板5次。

2.  自動洗板機：每孔注入洗液350μL，浸泡1min，洗板5次。

操作步驟

1.  從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。

2.  設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL；

3.  樣本孔先加待測樣本10μL，再加樣本稀釋液40μL；空白孔不加。

4.  除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

5.  棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板5次（也可用洗板機洗板）。

6.  每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.  每孔加入終止液50μL，15min內(nèi)，在450nm波長處測定各孔的OD值。

結果判斷

 繪制標準曲線：在Excel工作表中，以標準品濃度作橫坐標，對應OD值作縱坐標，繪制出標準品線性回歸曲線，按曲線方程計算各樣本濃度值。