根據(jù)酶分子大小和形狀的分離方法

(1)離心分離 許多酶往往富集于某一特定的細(xì)胞器內(nèi)，因此勻漿處理后應(yīng)先通過(guò)離心得到某一特定的亞細(xì)胞成分，如細(xì)胞核、線(xiàn)粒體、溶酶體等，使酶先富集10-20倍，然后再對(duì)某一特定的酶進(jìn)行純化。一般離心力越大，離心時(shí)間就越短。

(2)凝膠過(guò)濾 分離酶蛋白時(shí)，分于大小大于凝膠孔徑的蛋白被凝膠排阻，因而在凝膠顆粒間隙中移動(dòng)，速度較快；小分子蛋白質(zhì)則可自由出人凝膠顆粒的小孔內(nèi)，路徑加長(zhǎng)，移動(dòng)緩慢。這樣通過(guò)一定長(zhǎng)度的凝膠層析柱后，大小不同的分子蛋白就被分開(kāi)了。此外，凝膠過(guò)濾法還可用于測(cè)定未知蛋白的分子量。

(3)差速離心和等密度梯度離心分離 對(duì)于某一懸浮液，可先選用較低的轉(zhuǎn)速進(jìn)行離心，但分辨率較低，僅適用于粗提或濃縮。如果制備的離心介質(zhì)的密度梯度范圍包括了待分離樣品中所有顆粒的密度，那么經(jīng)較長(zhǎng)時(shí)間的離心后，各種顆粒沉降在與其密度相同的位置，這種離心稱(chēng)為等密度梯度離心。常用的離心介質(zhì)有氯化鋁、澳化鉀、碘化鈉等，這種方法在核酸研究中應(yīng)用更為廣泛。

(4)透析與超濾 透析在純化過(guò)程中極為常用，通過(guò)透析可以除去酶液中的鹽類(lèi)、有機(jī)溶劑、低分子量的抑制劑等。例如細(xì)菌蛋白酶經(jīng)丙烯睛濾膜一次超濾后可濃縮5倍左右，去除雜蛋白50%，去除于物質(zhì)70%，而酶活性保持75%以上。

根據(jù)酶分子電荷性質(zhì)的分離方法

(1)離于交換層析 根據(jù)不同的蛋白質(zhì)與離于交換劑的親合力不同而達(dá)到分離目的的方法稱(chēng)為離子交換層析。 由于不同的蛋白質(zhì)分于暴露在外表面的側(cè)鏈基團(tuán)的種類(lèi)和數(shù)量不同，因此在一定PH值和離于強(qiáng)度的緩沖液中，所帶的電荷情況也不相同的。因此在 上樣時(shí)應(yīng)注意加人的蛋白量及樣品體積盡可能小，才能得到較高的分辨率。洗脫時(shí)，可以通過(guò)改變洗脫劑的離子強(qiáng)度，減弱蛋白質(zhì)與載體親和力的方法，逐一洗脫各蛋白組分；也可通過(guò)改變洗脫劑的PH值，使蛋白質(zhì)的有效電荷減少而被解吸.

(2)等電聚焦電泳 它屬于移動(dòng)界線(xiàn)電泳法。具體操作方法如下：先從陽(yáng)極頂端擴(kuò)散裝人一種酸如磷酸，然后從陰ji端擴(kuò)散裝人一種堿如乙醇胺，這樣便可在兩端間建立起一PH梯度，此種PH梯度可以利用引人兩性電解質(zhì)混合物而加以穩(wěn)定。一般是用合成的或是天然的氨基酸當(dāng)作兩性電解質(zhì)混合物，而選用的等電點(diǎn)值要涵蓋所需的PH值。電泳時(shí)間可能需要數(shù)天，用這種方法可以分離和檢出等電點(diǎn)相差僅0.02的兩種蛋白成分。

(3)層析聚焦 層析聚焦類(lèi)似于等電聚焦，但其連續(xù)的PH梯度是在固相離于交換載體上形成的。它既具有等電聚焦的高分辨率，又具有柱內(nèi)容量大的特點(diǎn)，具有較大的應(yīng)用價(jià)值。3)電泳 在外電場(chǎng)作用下，由于蛋白質(zhì)離于所帶凈電荷的大小和性質(zhì)不同，因而其泳動(dòng)方向和速率也不同，從而達(dá)到分離的目的。 為減少擴(kuò)散，整個(gè)過(guò)程通常是在多孔性的固體載體如淀粉膠上進(jìn)行的。由于電泳分離的樣品量較小，常作為分析用；但現(xiàn)在已發(fā)展了制備電泳，用這種方法制備的酶，可以在介質(zhì)中洗脫或直接從電泳柱底部依次流出。