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Western blotting實驗完整流程從蛋白提取到出結(jié)果

時間:2023/2/10閱讀:613
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1.提蛋白

(不同細(xì)胞類型的蛋白或細(xì)胞不同部位的蛋白提取方法或有不同,需要提前查找資料)

我用的是凱基生物公司的全蛋白提取試劑盒 一般是取100 mg 標(biāo)本 + 1 ml lysis buffer + 10 ul 磷酸酶抑制劑 + 10ul PMSF + 1 ul 蛋白酶抑制劑 放入研磨器研磨,直至研磨成勻漿(注意冰上操作,有的試劑盒說明在研磨時加液氮),倒入EP管,放入離心機離心,12,000 g / 5 min,取上清。

另一種提蛋白試劑,用RIPA buffer (Gibco) + 1% cOmplete™, EDTA-free Protease Inhibitor (Sigma)

20mg樣品(盡量吸盡PBS) + 150 ul RIPA 溶液

冰上放置5~30min(趕時間可短)

蛋白定量-BCA測定方法(酶標(biāo)板操作)

 

(如果不同樣品總蛋白表達(dá)量以及蛋白組分差異大,總蛋白調(diào)齊之后還需要看內(nèi)參蛋白的表達(dá)是否一致,最后可根據(jù)內(nèi)參蛋白調(diào)整上樣量)

BSA標(biāo)準(zhǔn)品一般需用PBS稀釋液稀釋(按照protocol來)。釋待測樣品至合適濃度,使樣品稀釋液(稀釋后濃度一般不超過測得標(biāo)準(zhǔn)品的最高濃度),總體積為20 μL。據(jù)樣品數(shù)量,按50體積BCA試劑A加1體積BCA試劑B ( 50:1 ) 配制適量BCA工作液,充分混勻,每孔加入200 μL BCA工作液。

37℃放置30分鐘(可調(diào)整時間)后,以標(biāo)準(zhǔn)曲線0號管做參比,在562 nm波長下比色,記錄吸光值。以蛋白濃度 ( μg/ul )為橫坐標(biāo),吸光值為縱坐標(biāo),繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 y = 0.554x+0.0034

據(jù)所測樣品的吸光值(此處為y值)Average of triplicate, 代入y = 0.554x+0.0034 得到蛋白濃度x值,乘以稀釋倍數(shù)。根據(jù)蛋白上樣量確定體積(如上樣總體積16ul (加 混勻的4x Laemmli+β-巰基乙醇 煮沸變性),上樣量20ug,測得蛋白濃度5ug/ul,則取蛋白提取液體積 volume = 20/5 = 4ul),補PBS 8ul,再加4x Laemmli 4ul, 使上樣體積相等。一般99℃水浴變性5min(變性可嘗試不同時間,如3min、7min或更長),保存于-80℃。

(4x Laemmli 也可換成 5x loading buffer)加入5x loading buffer (即80ul 樣本 加 20ul loading buffer ),搖勻,可用封口膜封口 (防止煮沸時EP管口因壓力高而彈開) 煮沸變性(溫度時間根據(jù)蛋白可做相應(yīng)調(diào)整)。

2. wb

2.1 配膠

蛋白分子量大小不同,所使用的分離膠濃度也不同,常用濃度有6%、8%、10%、12%,分子量越大,所用的膠濃度越低,蛋白電泳速度越快。濃縮膠濃度均為 5%。分離膠的選擇:蛋白分子量很小時,推薦使用10-12%,例如蛋白分子量為 21kd 和 34kd ,選取的膠濃度為10%;分子量80kd,選10%;分子量180kd,選6%。

[電泳液也可用BIO-RAD 10x Tris/Glycine/SDS buffer, 直接取100ml buffer + 900ml 純水稀釋即可。配膠可用TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit, 10%或其它濃度]

加樣之前先簡單介紹一下。一般wb、免疫熒光、免疫組化等組織病理學(xué)實驗樣本要求是每組不低于3個,需要相互比較的組別加樣時放于同一塊膠上。測目標(biāo)蛋白之前先跑內(nèi)參蛋白,檢測各樣本的蛋白提取量是否相近。內(nèi)參蛋白量一致,再測目標(biāo)蛋白。一般我用GAPDH作為內(nèi)參蛋白(不同組織有區(qū)別),分子量~35kd。marker作為指示劑可以顯示目標(biāo)蛋白所處的條帶位置及大概分子量,一般加3~5ul。至于目標(biāo)蛋白,不同蛋白表達(dá)量不同,一般10~20ug,可根據(jù)第一次的結(jié)果進行調(diào)整。

2.2 電泳

電泳時長一般1.5h,先用80v 跑~30min,使各樣本處于同一水平,待marker開始分離后將電壓調(diào)至120v 再跑~1h。待loading buffer提示快跑出分離膠時,準(zhǔn)備配制轉(zhuǎn)膜液。配方如圖。

2.3 轉(zhuǎn)膜(濕跑法)

轉(zhuǎn)膜是整個wb過程中最重要的一步。Glycine14.1 g + Tris 3 g +800 ml 純水配好后,放入冰袋預(yù)冷,之后加甲醇 800ml。PVDF膜一般為2 x 8 cm 大小。PVDF膜和膠要時刻保持濕潤,不能干。將PVDF膜放入裝有甲醇的培養(yǎng)皿中活化~15秒,再倒入轉(zhuǎn)膜液。轉(zhuǎn)膜時要注意趕走膜與膠之間的氣泡。轉(zhuǎn)膜板如下圖,在兩層濾膜之間依次放入膠和PVDF膜(膠對應(yīng)轉(zhuǎn)膜板黑色面/儀器黑色面-連接電源負(fù)極,PCDF膜對應(yīng)轉(zhuǎn)膜板透明面/白色面/儀器紅色面-連接電源正極)。注意轉(zhuǎn)膜儀器正負(fù)極與電源相對應(yīng)。

轉(zhuǎn)膜時長和蛋白分子量有關(guān),一般100 kb以內(nèi)的蛋白,轉(zhuǎn)膜時長1kb / 1min,大于100kb,改為1kb / 1.5分鐘。一般是恒流 200mA,加冰袋;分子量大時,可用300mA,隔1h 換1次冰袋,因為轉(zhuǎn)膜過程會產(chǎn)生大量熱量,避免儀器燒壞。

(半干轉(zhuǎn)膜法)

可用BIO-RAD Trans-Blot Turbo 5x Transfer Buffer (1份 20ml) + ethanol (1份 20ml) + nanopure water (3份 60ml) (需預(yù)冷)

2A~2.5A,恒壓25V,10min(可根據(jù)需要改變條件)BIO-RAD儀器。

2.4 封閉和敷一抗

將PVDF膜放入封閉液(1% milk in 1x TBST + 0.1% Tween 20 )中,室溫下封閉~1h,也可根據(jù)需要延長至1.5h。封口膜大小一般3.5 x 10.5cm(可用封閉盒,盡量用純水或TBST清洗)。置于搖床上慢速搖~1h后,置于4℃冰箱過夜。

(驗證抗體很重要)

2.5 敷二抗和顯影

取出PVDF膜(條帶),用TBST洗滌3次,5min /次。若抗體效價不是很好,可適當(dāng)延長每次的洗滌時間。再用相同的封閉液稀釋二抗,置于搖床上搖1h。之后取出條帶再用TBST洗滌3次,5min /次。配顯影液,我用的是MILLIPORE品牌的,比例1:1,注意避光(可用錫箔紙)。每條帶滴約200ml 顯影液。

顯影成像時因不同曝光時間會影響成像效果,一般取欠曝光,適度曝光以及過度曝光多個曝光時間,取差異最大的圖像。

tips: 剛從新鮮組織提前的蛋白記得搖勻分裝,應(yīng)盡量在早期多做點wb條帶圖,便于后期數(shù)據(jù)補充分析,提取的蛋白存放時間久以及反復(fù)凍融,會導(dǎo)致蛋白降解,影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。

wb房間沒有空調(diào),夏天溫度太高導(dǎo)致膠很快就凝了,可以將玻璃板放在冰上預(yù)冷,冬天用純水可以壓平分離膠,夏天可以用異丙醇壓平。

TEMED具有神經(jīng)毒性和揮發(fā)性,應(yīng)在通風(fēng)口處使用,避免搖晃,避光低溫存儲。

因答主測量的蛋白分子量比較靠近,之前一塊膠只轉(zhuǎn)了一個蛋白,最近在想直接對整塊膠進行轉(zhuǎn)膜,對不同蛋白進行半定量分析,這樣既能減少上樣誤差,還可以直觀的看出不同蛋白間的變化趨勢。所以試了下對整塊膠進行轉(zhuǎn)膜,加入兩種抗體,此處一抗種屬來源不同,因此二抗也不一樣,最后條帶結(jié)果并不理想。目前還在摸索是否為抗體濃度的因素。

另外,如果是發(fā)好的paper,建議將膜保留下來,注意保濕(可保存8~9個月),部分投稿雜志會要求作者提供。

今天面試,教授們提了一個問題,希望與大家共勉。如何確定wb中特異性抗體結(jié)合的蛋白就是我們要的目標(biāo)蛋白,首先可以根據(jù)分子量大小判斷,可以做共沉淀把目標(biāo)蛋白拉下來送去做質(zhì)譜。可以對膜上的蛋白做色譜和質(zhì)譜聯(lián)合分析,另外特異性染色也可以做,抗二抗的抗體可以購買或者自己制作。

通過向同學(xué)深入的學(xué)習(xí),還可以做陰性對照和陽性對照。陰性對照(確定不表達(dá)或極微量表達(dá)目標(biāo)蛋白的樣品),比如基因敲除動物,對動物做DNA鑒定,確定沒有該蛋白對應(yīng)的基因序列,再提取蛋白做wb。陽性對照(確定表達(dá)目標(biāo)蛋白的樣品),比如某種模型或正常組就是會比該種實驗?zāi)P偷谋磉_(dá)高,可以做wb進行比較。

技術(shù)是一種手段,但是嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目蒲兴季S以及善于探索很重要。


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