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木質素過氧化物酶(Linin peroxidase ,Lip)試劑盒的使用方法

時間:2023/5/8閱讀:259
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                                                      規格:100管/96樣

木質素過氧化物酶(Linin peroxidase ,Lip)試劑盒說明書

微量法

注意:正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義

木質素過氧化物酶(EC1.11.1.14)是一種含亞鐵血紅素的過氧化物酶,屬于木質素降解酶系,在木質素生物降解、造紙工業、紡織工業、芳香化合物轉化與降解及環境污染控制等方面具有較大的應用潛力。

測定原理

木質素過氧化物酶氧化藜蘆醇生成藜蘆醛,在 310nm 處有特征吸收峰。

自備實驗用品及儀器

天平、研缽、低溫離心機、紫外分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96 孔板(UV 板)。

試劑組成和配制

試劑一:液體 115mL×1 瓶,4℃保存。

試劑二:液體 4mL×1 瓶,4℃避光保存。

試劑三:液體 2mL×1 支,4℃保存。

酶液提取

1. 組織:按照質量(g):試劑一體積(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g,加入1mL試劑一)加入試劑一,冰浴勻漿后于 4℃,10000g 離心10min,取上清置于冰上待測。

2. 細胞:按照細胞數量(104個):試劑一體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬細胞加入1mL試劑一),冰浴超聲波破碎細胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時間3min);然后 4℃,10000g 離心10min,取上清置于冰上待測。

3. 培養液或其它液體:直接檢測。

測定操作


測定管

試劑一(μL

120

試劑二(μL

40

樣品(μL

20

試劑三(μL

20

充分混勻,于微量石英比色皿/96 孔板,蒸餾水調零,測定 310nm 10s310s 吸光值,記為 A1 A2,△A=A2- A1

酶活計算公式

a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1.按照蛋白濃度計算

酶活性定義:每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol藜蘆醇所需的酶量為一個酶活力單位。

LiP 活性(nmol/min/mg prot=△A÷ε×d)×V反總÷(V樣×Cpr)÷T= 215×△A÷Cpr

2.按照樣本質量計算

酶活性定義:每克樣品每分鐘氧化1nmol藜蘆醇所需的酶量為一個酶活力單位。

LiP 活性(nmol/min/g=△A÷ε×d)×V反總÷(V樣×W÷V樣總)÷T= 215×△A÷W

3.按照細胞數量計算

酶活性定義:每104個細胞每分鐘氧化1nmol藜蘆醇所需的酶量為一個酶活力單位。

LiP 活性(nmol/min/104cell=△A÷ε×d)×V 反總÷(V 樣×細胞數量÷V 樣總)÷T

= 215×△A÷細胞數量

4.按照液體體積計算

酶活性定義:每升培養液每分鐘氧化1nmol藜蘆醇所需的酶量為一個酶活力單位。

LiP 活性(nmol/min/L=△A÷ε×d)×V 反總÷V 樣÷T= 2.15×105×△A

ε:藜蘆醛摩爾消光系數:9300L/mol/cmd:比色皿光徑,1cm;V 反總:反應總體積,1mL

V 樣:反應中樣本體積,0.1mL;V 樣總:加入提取液體積,1mL;Cpr:樣本蛋白濃度,mg/mLW:樣本質量,g;T:反應時間,5min

b. 96 孔板測定的計算公式如下

1.按照蛋白濃度計算

酶活性定義:每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol藜蘆醇所需的酶量為一個酶活力單位(U)。

LiP 活性(U/mg prot=△A÷ε×d)×V 反總÷(V 樣×Cpr)÷T= 430×△A÷Cpr

2.按照樣本質量計算

酶活性定義:每克樣品每分鐘氧化1nmol藜蘆醇所需的酶量為一個酶活力單位(U)。

LiP 活性(U/g=△A÷ε×d)×V 反總÷(V 樣×W÷V 樣總)÷T= 430×△A÷W

3.按照細胞數量計算

酶活性定義:每104個細胞每分鐘氧化1nmol藜蘆醇所需的酶量為一個酶活力單位(U)。

LiP 活性(U/104cell=△A÷ε×d)×V 反總÷(V 樣×細胞數量÷V 樣總)÷T

= 430×△A÷細胞數量

4.按照液體體積計算

酶活性定義:每升培養液每分鐘氧化1nmol藜蘆醇所需的酶量為一個酶活力單位(U)。

LiP 活性(U/L=△A÷ε×d)×V 反總÷V 樣÷T= 4.3×105×△A

ε:藜蘆醛摩爾消光系數:9300L/mol/cmd:比色皿光徑,0.5cm;V 反總:反應總體積,

1mLV 樣:反應中樣本體積,0.1mL;V 樣總:加入提取液體積,1mL;Cpr:樣本蛋白濃

度,mg/mLW:樣本質量,g;T:反應時間,5min



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