前 言
提高蛋白質功能及其穩定性，對合成生物學、生物制藥等產業具有重要意義。通過引入定點突變，改變蛋白質中某個位置的氨基酸，可以提升蛋白質的結構、穩定性或催化性能。
無細胞蛋白質合成技術利用從細胞中分離的翻譯機制進行模板基因的體外表達。由于無細胞蛋白質合成系統無需基因克隆和細胞培養步驟即可產生蛋白質，因此可作為酶庫高通量表達的通用平臺。運用無細胞蛋白合成技術，可以在微孔板中高通量合成相應蛋白，與后續基于微孔板的高通量檢測步驟能夠無縫銜接，從而實現包括基因構建、蛋白表達、檢測篩選在內的全流程高通量蛋白快速篩選。此外，無細胞蛋白質合成不需要維持細胞活力或膜完整性，因此可以更靈活地設計酶結構，提升酶活性 [1]。
珀羅汀生物基于自主研發的無細胞蛋白技術，利用無細胞蛋白表達試劑開發了高通量篩選應用場景，技術團隊以綠色熒光蛋白(GFP)為模型，在 13 小時內完成了近百個定點突變蛋白的高通量制備及表達驗證，快速獲得高性能的蛋白突變體。
實驗方法
定點突變
首先我們向GFP原始基因序列中分別引入95種定點突變(圖1)。通過使用帶有突變基因的引物對原始模板進行PCR的方式，將突變引入PCR產物當中，再用Dpn I 酶將原始模板質粒降解后，使用Seamless法將線性模板重新連接為環狀。達到獲得環狀且帶有突變氨基酸蛋白基因的目的。
圖1. 定點突變基因表達載體的構建流程
無細胞蛋白表達反應
構建完成突變基因載體后，我們進一步對載體進行體外擴增和高通量蛋白表達(圖2)。取少量連接完的帶有突變的環化模板，按照推薦的步驟，進行線性模板的PCR擴增。將擴增后的線性模板加入無細胞蛋白反應液后，進行無細胞反應。該步驟極大的減少了蛋白表達所需求的時間，在2-8h內就能在反應體系中生成目的蛋白。該技術操作簡便，極易與自動化工作站相結合。同時由于沒有細胞膜的限制，離心后的表達上清即可進行后續酶的活性檢測，進一步簡化實驗流程以達到節約人力及時間成本的目的。
圖2.突變基因擴增與無細胞蛋白表達
整體操作流程
通過上述方法，即可在13小時以內，完成近100個突變蛋白的基因構建、表達篩選。其中人工操作時間累計僅30分鐘，占全部時間的比例不到4%。運用無細胞蛋白表達技術，結合PCR、光學檢測等，實現了全流程的體外高通量篩選實驗，顯著了縮短了實驗時間，減少了人員工作量，這為加快研發周期，降低人力成本提供可能。
圖3.無細胞蛋白表達篩選流程的時間與試劑成本分析
突變體篩選結果
我們在綠色熒光蛋白活性中心的5個位點上(第64-69位氨基酸)，分別引入定點突變，每個位點均包括了所有可能的氨基酸(19種)，總計95種突變體。我們在96孔板上完成了基因構建、蛋白表達和熒光檢測分析，通過熒光信號檢測，我們獲得95種突變體對應的熒光值(圖4)。突變相應位點氨基酸能顯著改變蛋白的熒光特性。我們發現將GFP第66位的酪氨酸替換為組氨酸，原來的綠色熒光波長發生藍移(圖5)，有成為eBFP(增強型藍色熒光蛋白)的潛力。將GFP第66位的酪氨酸替換為色氨酸，同樣也能使得GFP的熒光波譜藍移，但藍移幅度略低于前述替換為組氨酸(圖6)，故該突變體有成為eCFP(增強型青色熒光蛋白)的潛力。
圖4.定點突變GFP在535nm波長的綠色熒光強度
圖5.定點突變GFP的450nm波長的藍色熒光強度
圖6.定點突變GFP的480nm波長的青色熒光強度
總結及展望
通過上述實驗，珀羅汀生物展示了一種運用無細胞蛋白表達技術，高通量篩選驗證點突變蛋白的方法。該方法在13小時內完成了近百種突變蛋白的構建表達及活性驗證，顯著縮短了蛋白篩選的時間，減少了人工操作，提高了研發效率。蛋白生物活性、穩定性的不斷提升，對于蛋白類產品在醫療、農業、造紙、紡織、生物能源、家庭護理等方面推廣應用，有著舉足輕重的作用。運用無細胞蛋白表達技術，能夠更高效快速地完成蛋白質改造與篩選，縮短酶制劑、蛋白藥物等各類蛋白產品的研發周期，降低研發成本，從而促進新型重組蛋白、酶、抗體等蛋白產品快速的發展。
珀羅汀生物作為一家專業的無細胞蛋白表達生物技術公司，將繼續利用無細胞蛋白表達技術優勢，開發更為廣泛的應用場景。
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