摘要
酶是自然界重要的功能蛋白分子，其催化活性在基因編輯及干細胞技術(shù)、靶向藥物的生產(chǎn)、食品工業(yè)、紡織工業(yè)、醫(yī)學診斷、藥物制備等領(lǐng)域都有著重要的作用。本文中，我們以phi29 DNA聚合酶為代表，利用無細胞蛋白表達技術(shù)，搭建了高通量酶篩選平臺。結(jié)果顯示，在三天內(nèi)，我們就完成了96個phi29 DNA聚合酶突變體的表達，并對其活性進行了檢測，找到了較為高效的phi29 DNA聚合酶突變體。
近幾年，隨著AI技術(shù)的進步，AI輔助蛋白設(shè)計正在逐漸成為現(xiàn)實。在AI的設(shè)計-構(gòu)建-測試-學習周期中，構(gòu)建和測試對AI的成長有著極大的作用。
一般傳統(tǒng)的蛋白表達流程為：
利用半理性的方式完成突變體基因的構(gòu)建后，將構(gòu)建的基因搭載至質(zhì)粒上，再將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進載體細胞內(nèi)。然后從涂布的平板上挑取單克隆進行擴大培養(yǎng)，隨后可以得到表達突變體蛋白的細胞株。通過細胞株的擴大培養(yǎng)，之后裂解相應(yīng)細胞，即可得到含有目的突變蛋白的混合液。在此之后就可以進行突變蛋白的純化和測試操作。該方法操作復(fù)雜且流程較長，如果目的突變蛋白對宿主細胞有毒害作用的話，可能會導(dǎo)致表達失敗。
對于這種高通量篩選來說，無細胞蛋白表達顯然是一種更有效的選擇。無細胞蛋白表達技術(shù)，利用裂解的生物體的生物質(zhì)，如核糖體、轉(zhuǎn)錄翻譯酶等成分，再加入合適的能量氨基酸等支持體系，即可在體外借助加入的模板DNA，實現(xiàn)快速高效的蛋白表達。無細胞蛋白表達技術(shù)可以有效地簡化蛋白表達的操作，使其更易于匹配高通量的應(yīng)用場景。同時其快速表達的特點，可以縮短蛋白表達的時間，有效縮短項目周期。
本文我們以phi29 DNA聚合酶為例子，利用無細胞蛋白表達技術(shù)，在三天內(nèi)高效表達出了96個蛋白酶突變體，并檢測其活性。揭示了無細胞技術(shù)在蛋白酶及藥物高通量篩選中的潛在應(yīng)用。
突變引入及環(huán)化
我們選取了phi29DNA聚合酶的第221位和第350位氨基酸作為突變位點。先利用PCR的方式，將突變通過引物引入片段；再通過重疊PCR的方式整合突變片段。將整合好的目的基因片段和線性化的環(huán)狀片段通過seamless酶進行連接，形成環(huán)化質(zhì)粒。
在此過程中，每次以質(zhì)粒為模板進行PCR之后，使用Dpn I 酶37℃消化1h以去除原始模板。
質(zhì)粒轉(zhuǎn)化并涂板
取5μL引入突變的質(zhì)粒，加入到100μL DH5α感受態(tài)細胞中，輕輕混勻，置于冰上30min。接著，將上述感受態(tài)細胞置于42°C水浴中，熱激90秒后迅速放回冰浴中，靜置3~5min；再將其加入到500 ul不含抗生素的SOC或LB培養(yǎng)液中，輕輕混勻，37°C震蕩培養(yǎng)1h。隨后，通過離心菌液（5000 rpm ，1min）沉淀菌體，再將大部分培養(yǎng)液移除，剩余約50-100μL的培養(yǎng)液后重懸菌體，最后，全部均勻涂布到含卡那霉素的LB平板上，在37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。
挑取單克隆并保菌
向96孔板中加入100μL含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基，然后從LB培養(yǎng)板上挑取單克隆菌落加入96孔板中。再置于37℃的搖床中180rpm震蕩培養(yǎng)1h。
菌體PCR及高通量蛋白表達
從震蕩培養(yǎng)1h的96孔板的每個孔中取出1μL培養(yǎng)基，作為模板加入PCR體系。在經(jīng)過適當?shù)腜CR程序后，取5μLPCR反應(yīng)體系，作為模板加入無細胞表達體系中。表達4個小時后，即可在體系中產(chǎn)生目的蛋白酶——phi29 DNA 聚合酶。
活性測定
Phi29 DNA聚合酶的活性測定是利用聚合酶活性來擴增綠色熒光蛋白基因的線性模板，通過最終產(chǎn)物綠色熒光的強度對phi29 DNA聚合酶的活性做出判斷。首先從最終的無細胞反應(yīng)體系中直接取出1μL的反應(yīng)上清液作為酶溶液加入到擴增體系，該體系含有使phi29起效的緩沖液、綠色熒光蛋白基因的質(zhì)粒模板以及擴增所需的引物。然后在42℃的條件下擴增2h生成線性模板。最后取5μL的線性模板加入到終體積為50μL的無細胞反應(yīng)體系中，6小時后測定其熒光值，找出活性較強的phi29 DNA聚合酶突變體。
活性結(jié)果
在激發(fā)波長485nm發(fā)射波長535nm的條件下，測定綠色熒光蛋白的熒光值。不同孔中的熒光值有明顯的不同，表明不同phi29 DNA聚合酶的突變體有不同的活性強度。
突變測序
測定活性之后，從之前保存的96孔培養(yǎng)板上取活性強度較高的幾個孔位所對應(yīng)的菌體，擴大培養(yǎng)后進行測序操作。我們成功找到了在此板上活性強度的phi29 DNA聚合酶突變體。其在221位和350位的氨基酸組合如下所示。
| 活性排名 | 221 | 350 |
| 1 | 苯丙氨酸 | 苯丙氨酸 |
| 2 | 苯丙氨酸 | 酪氨酸 |
| 3 | 異亮氨酸 | 蘇氨酸 |
通過上述實驗，珀羅汀生物展示了一種運用無細胞蛋白表達技術(shù)，高通量篩選并驗證突變蛋白的方法。該方法在3天內(nèi)完成了近百種突變蛋白的構(gòu)建表達及活性驗證，顯著縮短了蛋白篩選的時間，減少了人工操作成本，提高了研發(fā)效率。
蛋白質(zhì)生物活性和穩(wěn)定性的不斷提升，對于蛋白類產(chǎn)品在醫(yī)療、農(nóng)業(yè)、造紙、紡織、生物能源、家庭護理等方面推廣應(yīng)用，有著舉足輕重的作用。運用無細胞蛋白表達技術(shù)，能夠更高效快速地完成蛋白質(zhì)改造與篩選，縮短酶制劑、蛋白藥物等各類蛋白產(chǎn)品的研發(fā)周期，降低研發(fā)成本，從而促進新型重組蛋白、酶、抗體等蛋白產(chǎn)品的快速發(fā)展。
珀羅汀生物作為一家專業(yè)的無細胞蛋白表達生物技術(shù)公司，將繼續(xù)利用無細胞蛋白表達技術(shù)優(yōu)勢，開發(fā)更為廣泛的應(yīng)用場景。
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