涉及濕熱滅菌生物指示劑試驗指將一定量的已知D值微生物耐熱孢子接種到待滅菌的產品中，在設定的滅菌程序條件下限滅菌，以驗證設定的滅菌工藝程序是否確實賦予產品所設定的F0值，由此進行的實驗和評價過程也稱為挑戰性試驗。
濕熱滅菌生物指示劑操作步驟如下：
濕熱滅菌生物指示劑驗證方案制定的重點在產品的熱穩定性、產品的污染水平與污染菌的耐熱數據。
（1）產品分析（接種模擬污染水平≥生產污染水平）；
（2）確定菌種孢子，選擇強于產品常見污染菌的熱耐受菌種孢子（菌種孢子含量的準確性，質量資料具備可追溯性，在有效期內）；
（3）選取非致病菌，且具有良好的重現性能；
（4）應在接種同時留置多支陽性對照品，試驗過程同步采樣培養。
濕熱滅菌生物指示劑充分采用熱分布及熱穿透的工作數據
裝載和樣品按照熱穿透布置不變。特別關注滅菌釜的zui冷點、次冷點以及同步點樣品編號。
設置試驗溫度滅菌限（也稱低限滅菌）
既低于設計值，比F0 低3 %——5%進行滅菌。由此而設計滅菌程序時間，如滅菌值F0 產品計算下限為8.5，設計為8.3限。
濕熱滅菌生物指示劑按擬訂下限滅菌程序結束
（1）QC現場采樣，試驗編號數據和對照品編號數據同步收集；
（2）樣品按照確定菌種孢子培養要求（一般在特定溫度和有好氧與厭氧條件區分）；
（3）實驗樣品和陽性品同條件分別培養觀測。如陽性品正常培養失敗，既可判試驗無效而失敗。因盾之不存，矛的鋒利無從談起。
濕熱滅菌生物指示劑檢測試驗的重現性
每一品種規格的滅菌程序至少應進行3次以上的試驗，試驗的數據必須穩定一致，重現性良好。否則，查找原因，重新開始。
生物指示劑挑戰性試驗是一項典型的滅菌安全性評價驗證，需要工藝人員試驗技師和QC方面密切的配合和的設計。達到2.6.4與2.6.5可接受的標準后，可以證實試驗成功，它代表工藝設計的滅菌程序與參數是合理的，也賦予了產品足夠的安全性。另一方面，也證實前期設備的選擇是符合生產需要的硬件。
操作擬訂的SOP、SMP把生產技術操作過程置于可控范圍，至此本項驗證工作可以告結束，轉入下一項定期再驗證流程。這樣，為將來產品滅菌質量保證鎖上了“第二把鎖” 。