利用改進的CRISPR/Cas9技術直接改變細胞身份

在一項新的研究中，研究人員利用經過基因修飾的CRISPR/Cas9---一種新的革命性的基因編輯技術---將從小鼠結締組織中分離出的成纖維細胞直接轉化為神經元。

2006年，日本京都大學前沿醫學科學研究所山中伸彌教授發現如何讓來自成年結締組織的成纖維細胞返回到未成熟的能夠分化為任何一種細胞類型的干細胞。這些所謂的誘導性多能干細胞（iPS細胞）因在研究和醫學中的巨大潛力僅在6年后就讓山中伸彌教授獲得諾貝爾獎。

從那之后，科學家們已發現其他的方法將一種類型的細胞轉化為其他類型的細胞。這主要是通過導入多種額外拷貝的“主開關”基因---表達激活特定細胞類型所需的整個基因網路的蛋白---來實現的。

如今，在這項新的研究中，來自美國杜克大學的研究人員開發出一種不再需要導入額外基因拷貝的策略。相反，他們利用一種經過基因修飾的CRISPR/Cas9基因編程技術直接激活已經存在于細胞基因組中的自然拷貝。相關研究結果于2016年8月11日在線發表在Cell Stem Cell期刊上，論文標題為“Targeted Epigenetic Remodeling of Endogenous Loci by CRISPR/Cas9-Based Transcriptional Activators Directly Converts Fibroblasts to Neuronal Cells”。

這些早期的研究結果表明相比于*性地將新的基因加入到宿主細胞基因組中的方法，利用這種經過基因修飾的CRISPR/Cas9方法實現小鼠胚胎成纖維細胞直接變成神經元的轉化過程更加*和更加持久。

這些神經元細胞可能能夠被用來構建神經疾病模型、發現新的治療方法和開發個人化療法，而且可能在未來開展細胞療法。

論文通信作者、杜克大學生物分子與組織工程中心主任和生物醫學工程副教授Charles Gersbach博士說，“這種技術在科學研究和醫學上具有很多應用。比如，我們可能對大多數人的神經元如何對藥物作出反應產生一種粗略的印象。獲取你大腦的活組織樣品來測試你的神經元在倫理上是不允許的。但是如果我們能夠從你的手臂獲得皮膚細胞，將它轉化為神經元，然后利用多種藥物組合對它進行處理，我們就可能確定出一種*的個人化療法。”

論文*作者、Gersbach實驗室研究生Joshua Black說，“面臨的挑戰就是地產生穩定的神經元，而且它們看起來非常類似于你體內真正的神經元。這一直是這個領域的重大障礙。”

二十世紀五十年代，英國發育生物學家Conrad Waddington教授提出未成熟的干細胞分化為特定類型的成體細胞就好像是從一座有脊的山峰沿著側邊滾到眾多山谷中的一種。當一種細胞沿著一種特定的斜坡選擇每種路徑后，它對*目的地的選擇會變得越來越少。

你想要改變這種目的地，一種方法就是將這種細胞垂直地推回到山頂上---這就是將細胞重編程為iPS細胞的想法。另一種選擇就是水平地讓這種細胞向上翻越一個小山峰，直接進入另一種山谷。

Gersbach說，“如果你能夠特特異性地激活所有的神經元基因，那么就可能不一定需要向上翻越這個小山峰。”

之前的方法是通過導入攜帶額外基因拷貝---能夠在細胞內產生大量被稱作主轉錄因子的蛋白---的病毒來做到這一點的。這些蛋白（依據不同的細胞類型，存在不同）結合到基因組上的上千個位點，激活靶細胞的特定基因網絡。然而，這種方法也存在一些缺點。

Black說，“不是通過病毒*性地導入現存基因的額外拷貝而是通過提供一種暫時的信號以一種穩步的方式改變細胞類型將是可取的。然而，地做到這一點可能需要對細胞的基因程序作出非常特異性的改變。”

在這項新的研究中，Black、Gersbach和同事們利用經過基因修飾的CRISPR/Cas9技術準確地激活三種基因Brn2、Ascl1和Myt1l來自然地產生這些控制神經元基因網絡的主轉錄因子，而不是導入攜帶這些額外基因拷貝的病毒。

研究人員先將細菌防御系統CRISPR/Cas9進行基因修飾讓它與一種基因激活物偶聯在一起，這樣仍然能夠鑒定出特異性的DNA片段，但是不會切割靶片段，而是讓它們保持完整，同時利用基因激活物將靶片段激活。

在實驗室中，將這種經過基因修飾的CRISPR/Cas9系統注射到小鼠胚胎成纖維細胞中。檢測結果表明一旦被這種系統激活，這三種神經元主轉錄因子基因就強力地激活神經元基因。這導致這些成纖維細胞傳導電信號---神經元的一種典型特征。而且即便將與CRISPR/Cas9偶聯的基因激活物取走后，這些細胞仍然保持它們的神經元性質。

Gersbach說，“當將攜帶表達這三種主轉錄因子的基因的病毒導入細胞中時，也可能讓這些細胞表現得像神經元一樣。但是如果它們真地變成自主發揮功能的神經元，那么它們就應當不需要這種外部的刺激持續存在。” 

這些實驗證實利用這種經過基因修飾的CRISPR/Cas9技術產生的神經元在靶基因上的表觀遺傳程序與在小鼠大腦組織中自然發現的神經元標志相匹配。

Black解釋道，“利用病毒引入額外基因拷貝的方法大量地產生這些轉錄因子，但是這些基因的自然拷貝非常少地產生這些蛋白。相比之下，這種經過基因修飾的CRISPR/Cas9方法總體上并不產生如此多的轉錄因子，但是它們是由正常的染色質位點產生的，這就是這些基因在穩步激活后發生的顯著差別。我們啟動這種表觀遺傳開關來改變細胞類型，而不是通過合成方式迫使它們這樣做。”

根據Black的說法，接下來的行動方案就是將這種方法拓展到人類細胞中，提高這種技術的效率，并且試圖清除其他的表觀遺傳障礙，這樣它可能能夠用來構建特定疾病模型。

Gersbach說，“在未來，你能夠想象在體外制造神經元并將它們移植到大腦中來治療帕金森病或其他神經退行性疾病。但是即便我們不能夠走到這一步，我們仍然能夠在實驗室中利用這種方法大展手腳來協助開發更好的療法。