胎牛血清培養血管平滑肌細胞常用的方法
胎牛血清培養血管平滑肌細胞常用的方法有貼塊法(explant)和酶解離法(enzyme disperse)。下面一起來看下這兩種方法。
1、貼塊法
方法:動物經頸動脈放血后,在無菌操作下迅速取出胸腹主動脈段,置于含Hank's液的平皿中漂洗3次,將凝塊洗干凈后剝除外膜的纖維脂肪層,然后縱行切開血管,刮除內膜即內皮細胞迅速撕下中膜內、中層,切成約1mm寬的小條,浸泡在含血清的Hank's液中,并將撕下小組織塊種植于培養瓶壁。置于37℃恒溫箱,2h左右,取出培養瓶加入20% HyClone胎牛血清的培養液,再放回培養箱內靜止培養4天。4天后可見細胞從組織中遷移游出。
不同動物血管結構有差異,豬和猴較易操作,但小動物如兔、鼠因其血管小,血管壁薄等特點,使之難以分離。另外組織塊太薄,不易粘附培養基,也使細胞較難生長。為了保證培養的成功,應注意:
①種植組織塊的數目,如75cm2的長頸瓶組織塊不得少于30;
②根據培養細胞的種屬加入適量的不同血清,一般可加入牛血清,若小牛血清增殖效果差,應加胎牛血清(FBS),通常濃度為10%~20%;
③培養基的選擇:常用的有DMEM(Dulbecco's modified Eagles'medium),M199培養基。培養兔的平滑肌細胞用DMEM效果較好。
2、酶解離法
沿動脈縱軸切開后,刮除內皮細胞撕下中膜的內2/3,注意不要混入內皮細胞,將組織塊切成1-2mm2,放入加有3mg/ml膠原酶的無血清M199培養基中,37℃,0.5~1.5h。離心去上清,重復上述消化步驟,然后再離心(9000r,4min),收集細胞,在5%~10%同種血清或HyClone胎牛血清的M199培養基中調整細胞數,然后轉入30~90mm培養皿中培養,對于兔子應加入高濃度的谷氨酰胺(0.2g/L)較佳。不同研究者在培養基、酶濃度以及消化時間等的選擇都有很大的差異。
綜上所述,貼塊法具有獲得平滑肌細胞純度高,量多,操作簡便的優點。但用貼塊法易使平滑肌細胞胞質內肌絲喪失,亞細胞器增加。相反,酶解離法,由于酶的作用使細胞間失去連接,細胞內肌絲含量豐富,保持收縮型狀態。培養平滑肌細胞常取材于兔、豬、鼠、猴的胸腹主動脈段。由于貼塊法和解離法處理方式不同,在細胞培養的zui初階段細胞形態和性質存在差異。隨著培養時間的延長,培養環境趨于一致,細胞特性上也趨于近似。