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參考價 | ¥550-¥1000 |
參考價:¥550 ~ ¥1000
100管/48樣 50管/24樣
CAS:詳見說明書 純度:詳見說明書 分子量:詳見說明書 分子式:詳見說明書 供貨周期:現貨 規格:100管/48樣、50管/24樣 貨號:YLK-SH123 應用領域:化工,生物產業 主要用途:科研
>100管/48樣 | 1000元 | 125盒可售 |
50管/24樣 | 550元 | 157盒可售 |
更新時間:2024-06-29 15:38:34瀏覽次數:677評價
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CAS | 詳見說明書 | 純度 | 詳見說明書 |
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分子量 | 詳見說明書 | 分子式 | 詳見說明書 |
供貨周期 | 現貨 | 規格 | 100管/48樣、50管/24樣 |
貨號 | YLK-SH123 | 應用領域 | 化工,生物產業 |
主要用途 | 科研 | 測定方法: | 微量法、可見分光光度法 |
輔酶ⅡNADP(H)含量試劑盒說明書
微量法 100管/48樣
注 意:正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定
測定意義:
輔酶ⅡNADP(H)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養細胞中,NADP+和NADPH含量測定可以計算NADP(NADPH + NADP+ )含量和NADPH/NADP+比值,其變化與磷酸戊糖途徑和生物合成以及抗氧化反應密切相關。NADPH/NADP+比值不僅是細胞氧化還原態的主要標志之一,而且在PPP途徑、生物合成和抗氧化代謝中具有重要調控作用。
測定原理:
分別用酸性和堿性提取液提取樣品中NADP+和NADPH。NADPH通過PMS的遞氫作用,使氧化型噻唑藍(MTT)還原為甲瓚,570nm下檢測吸光值,從而測定NADPH含量。利用6-磷酸葡萄糖脫氫酶還原NADP+為NADPH,從而檢測NADP+含量。
所需的儀器和用品:
酶標儀、臺式離心機、可調式移液器、96孔板、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制:
酸性提取液:液體50mL×1瓶,4℃保存;
堿性提取液:液體50mL×1瓶,4℃保存;
試劑一:液體10 mL×1瓶,4℃保存;
試劑二:粉劑×1支,-20 ℃保存,用時加入3mL蒸餾水,混勻;溶解后4 ℃保存一周;
試劑三:粉劑×1支,-20℃保存,用時加入3mL蒸餾水,混勻;溶解后4℃保存一周;
試劑四:粉劑×1支,4 ℃保存,用時加入3mL蒸餾水,混勻;溶解后4℃保存一周;
試劑五:液體3.6mL×1支,4 ℃保存;
試劑六:液體30mL×1瓶,4 ℃保存;
試劑七:液體50mL×1瓶,4 ℃保存。
NADP+和NADPH的提取:
1 血清(漿)中NADP+和NADPH的提取
NADP+的提取:按照血清(漿)體積(mL):酸性提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議取約0.1mL血清(漿),加入1mL酸性提取液),95℃水浴5min(蓋緊,以防止水分散失);冰浴中冷卻后,10000g 4 ℃離心10min;取500μL上清液,加入500μL堿性提取液使之中和,混勻,10000g 4 ℃離心10min,取上清,置冰上待測。
NADPH的提取:按照血清(漿)體積(mL):堿性提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議取約0.1mL血清(漿),加入1mL堿性提取液),95℃水浴5min(蓋緊,以防止水分散失);冰浴中冷卻后,10000g 4 ℃離心10min;取500μL上清液,加入500μL酸性提取液使之中和,混勻,10000g 4 ℃離心10min,取上清,置冰上待測。
2組織中NADP+和NADPH的提取:
NADP+的提取:按照組織質量(g):酸性提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議取約0.1g組織,加入1mL酸性提取液),冰浴研磨,95℃水浴5min(蓋緊,以防止水分散失);冰浴中冷卻后,10000g 4 ℃離心10min;取500μL上清液,加入500μL堿性提取液使之中和,混勻,10000g 4 ℃離心10min,取上清,置冰上待測。
NADPH的提取:按照組織質量(g):堿性提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議取約0.1g組織,加入1mL堿性提取液),冰浴研磨,95℃水浴5min(蓋緊,以防止水分散失);冰浴中冷卻后,10000g 4 ℃離心10min;取500μL上清液,加入500μL酸性提取液使之中和,混勻,10000g 4 ℃離心10min,取上清,置冰上待測。
3 細胞或細菌中NADP+和NADPH的提取:
NADP+的提取:先收集細胞或細菌到離心管內,棄上清,按照細菌或細胞數量(104個):酸性提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細菌或細胞加入1mL酸性提取液),超聲波破碎(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復30次),95℃水浴5min(蓋緊,以防止水分散失);冰浴中冷卻后,10000g 4 ℃離心10min;取500μL上清液,加入500μL堿性提取液使之中和,混勻,10000g 4 ℃離心10min,取上清,置冰上待測。
NADPH的提取:先收集細胞或細菌到離心管內,棄上清,按照細菌或細胞數量(104個):堿性提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細菌或細胞加入1mL堿性提取液),超聲波破碎(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復30次),95℃水浴5min(蓋緊,以防止水分散失);冰浴中冷卻后,10000g 4 ℃離心10min;取500μL上清液,加入500μL酸性提取液使之中和,混勻,10000g 4 ℃離心10min,取上清,置冰上待測。
測定步驟:
1、 分光光度計或酶標儀預熱30min以上,調節波長至570nm,蒸餾水調零。
2、 加樣表(在1.5mL棕色EP管中按下表依次加樣):
試劑名稱(μL) | 對照管 | 測定管 |
樣本 | 20 | 20 |
試劑一 | 80 | 80 |
試劑二 | 30 | 30 |
試劑三 | 30 | 30 |
試劑四 | 30 | 30 |
試劑五 | 30 | 30 |
試劑六 | 200 | 混勻,室溫避光靜置20min |
試劑六 | 200 |
充分混勻,靜置5min后,20000g,25℃離心5min,棄上清,沉淀中加入:
試劑七 | 400 | 400 |
混勻,取200μL轉移至微量石英比色皿或96孔板中,570nm下讀取對照吸光值A1和測定管吸光值A2,計算△A=A2-A1。
注意事項:
1、如果一次性測定樣本數較多,可將試劑一、二、三和四按比例配成混合液。
2、對照管和測定管的測定步驟的區別:對照管加完試劑一、二、三、四和五后必須馬上加試劑六;測定管加完試劑一、二、三、四和五后必須反應20min后再加試劑六。
3、反應過程中注意避光。
4、若NADP+測定中△A(A2-A1)≤0.0144,NADPH測定中△A(A2-A1)≤0.0259,說明樣本中輔酶含量較低,已低于檢測限,可做如下調整:(1)將測定管避光靜置時間20min延長到60min;(2)在提取階段增加取樣量,即取0.2g樣本或0.2mL樣本加入1mL提取液。
5、由于每一個測定管需要設一個對照管,本試劑盒100管保證測48個NADP+或NADPH.
NADP+和NADPH含量的計算:
(一)NADP+含量的計算
標準條件下的回歸曲線為y = 0.0985x + 0.0144,R2 = 0.9998;其中y為△A,x為NADP+濃度nmol/mL
1、血清(漿)中NADP+含量計算
NADP+含量(nmol/mL)=[ (△A -0.0144)÷0.0985×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 203×(△A -0.0144)
2、組織、細菌或細胞中NADP+含量計算
(1)按樣本蛋白濃度計算
NADP+ (nmol/mg prot)=[(△A -0.0144)÷0.0985×V1) ]÷(V1×Cpr)= 10.2×(△A -0.0144)÷Cpr
(2)按樣本鮮重計算
NADP+ (nmol/g 鮮重)= [(△A -0.0144)÷0.0985×V1)] ÷(W×V1÷V2)=20.3×(△A -0.0144)÷W
(3)按細菌或細胞密度計算
NADP+ (nmol/104 cell)=[(△A -0.0144)÷0.0985×V1)] ÷(500×V1÷V2)=0.04×(△A -0.0144)
(二)NADPH含量的計算
標準條件下的回歸曲線為y = 0.6198x + 0.0259,R2 = 0.9977;其中y為△A,x為NADPH濃度nmol/mL
1、血清(漿)中NADPH含量計算
NADPH含量(nmol/mL)= [(△A -0.0259)÷0.6198×V1)] ÷(V3×V1÷V2)= 32.3× (△A -0.0259)
2、組織、細菌或細胞中NADPH含量計算
(1)按樣本蛋白濃度計算
NADPH (nmol/mg prot)=[ (△A -0.0259)÷0.6198×V1)] ÷(V1×Cpr)= 1.6× (△A -0.0259)÷Cpr
(2)按樣本鮮重計算
NADPH (nmol/g 鮮重)=[(△A -0.0259)÷0.6198×V1) ]÷(W×V1÷V2)=3.2× (△A -0.0259)÷W
(3)按細菌或細胞密度計算
NADPH (nmol/104 cell)=[(△A -0.0259)÷0.6198×V1) ]÷(500×V1÷V2)=0.006× (△A -0.0259)
V1:加入反應體系中樣本體積,0.02mL;V2:加入提取液體積,2mL;V3:加入血清(漿)體積:0.1mL;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL; W:樣本質量,g;500:細胞或細菌總數,500萬。
注 意:Z低檢測限為0.01nmol/mL或0.01nmol/g鮮重 或0.001nmol/mg prot
輔酶ⅡNADP(H)含量試劑盒僅供科研!