目錄:優(yōu)利科(上海)生命科學有限公司>>科研試劑盒>>生化試劑盒>> 氧化型谷胱/甘肽(GSSG)含量測試盒
供貨周期 | 現(xiàn)貨 | 規(guī)格 | 100T/96S |
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貨號 | YLK-SH141 | 應用領域 | 化工,生物產(chǎn)業(yè) |
主要用途 | 科研 | 測定方法: | 微量法 |
氧化型谷胱/甘肽(GSSG)含量測試盒說明書
微量法100T/96S
注 意:正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。
測定意義:
GSH/GSSG是細胞內(nèi)最重要的氧化還原對之一。因此,測定細胞內(nèi)GSH和GSSG含量以及GSH/GSSG比值,能夠很好地反映細胞所處的氧化還原狀態(tài),也是谷胱/甘肽氧化還原循環(huán)的主要指標之一。
測定原理:
利用2-VP法測GSSG含量。
自備儀器和用品:
低溫離心機、水浴鍋、可調(diào)節(jié)移液器、可見分光光度計/酶標儀、微量玻璃比色皿/96孔板、和蒸餾水。
試劑組成和配置:
試劑一:液體100mL×1瓶,4℃保存。
試劑二:液體600μL×1支,4℃保存。
試劑三:液體50mL×1瓶,4℃保存。
試劑四:液體2.5mL×1瓶,4℃保存。
試劑五: 液體15μL×1瓶,-20℃保存。臨用前加入0.3mL試劑三稀釋,4℃保存。
試劑六:粉劑×1瓶,4℃保存。臨用前加入20 mL試劑三溶解,現(xiàn)配現(xiàn)用。
粗酶液提取:
1. 組織:按照組織質(zhì)量(g):試劑一體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL試劑一)進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min,取上清液(如上清不清澈,再離心3min)待測。
2. 細菌、真菌:按照細胞數(shù)量(104個):試劑一體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細胞加入1mL試劑一),冰浴超聲波破碎細胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時間3min);8000g 4℃離心10min,取上清液(如上清不清澈,再離心3min)混勻待測。
3. 血清等液體:直接測定。
GSSG含量測定:
1. 分光光度計/酶標儀預熱30min,調(diào)節(jié)波長到412nm,蒸餾水調(diào)零。
2. 試劑三置于25℃(一般物種)或者37℃(哺乳動物)水浴中保溫30min。
3.取1 mL EP管,加入100μ L上清液,5 μ L試劑二,蓋緊后混勻,得混合液,置于37℃水浴30min;取21μ L混合液于96孔板,然后依次加入20 μ L試劑四、2 μ L試劑五和140 μ L試劑六,迅速混勻后,測定30 s和150 s光吸收A1和A2,計算ΔA=A2-A1。
GSSG含量計算公式:
a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下
1、標準條件下測定的回歸方程為y=0.0276x-0.0011;x為標準品濃度(nmol/mL),y為吸光值(ΔA)。
2、 按蛋白濃度計算
GSSG(nmol/mg prot)=(ΔA+0.0011)÷0.0276×V樣÷(V樣×Cpr)
=36.23×(ΔA+0.0011)÷Cpr
3、按樣本鮮重計算
GSSG(nmol /g 鮮重)=(ΔA+0.0011)÷0.0276×V樣÷(V樣÷V樣總×W)
=36.23×(ΔA+0.0011)÷W
4、按細胞數(shù)量計算
GSSG(nmol/104 cell)=(ΔA+0.0011)÷0.0276×V樣÷(V樣÷V樣總×細胞數(shù)量)
=36.23×(ΔA+0.0011)÷細胞數(shù)量
5、按照液體體積計算
GSSG(nmol/mL)=(ΔA+0.0011)÷0.0276×V樣÷V樣
=36.23×(ΔA+0.0011)
V樣:反應中加入樣本體積,20μL;V樣總:加入提取液體積, 1mL;W:樣品質(zhì)量,g,Cpr:樣本蛋白濃度(mg/mL)
b.使用96孔板測定的計算公式如下
1、標準條件下測定的回歸方程為y=0.0138x-0.0011;x為標準品濃度(nmol/mL),y為吸光值(ΔA)。
2、 按蛋白濃度計算
GSSG(nmol/mg prot)=(ΔA+0.0011)÷0.0138×V樣÷(V樣×Cpr)
=72.46×(ΔA+0.0011)÷Cpr
3、按樣本鮮重計算
GSSG(nmol /g 鮮重)=(ΔA+0.0011)÷0.0138×V樣÷(V樣÷V樣總×W)
=72.46×(ΔA+0.0011)÷W
4、按細胞數(shù)量計算
GSSG(nmol/104 cell)=(ΔA+0.0011)÷0.0138×V樣÷(V樣÷V樣總×細胞數(shù)量)
=72.46×(ΔA+0.0011)÷細胞數(shù)量
5、按照液體體積計算
GSSG(nmol/mL)=(ΔA+0.0011)÷0.0138×V樣÷V樣
=72.46×(ΔA+0.0011)
V樣:反應中加入樣本體積,20μL;V樣總:加入提取液體積, 1mL;W:樣品質(zhì)量,g,Cpr:樣本蛋白濃度(mg/mL)
注意事項
1.提取過程中去掉蛋白質(zhì),所以提取液不能用于測定蛋白含量。
2.臨用前配制的試劑配好后4℃保存,2天內(nèi)使用完畢。
3.Z低檢出限為0.1μmol/L。
4.反應溫度嚴格來說,為保證重復性,應在25℃下進行反應。
5. 反應時間需精確控制,否則會影響反應速率計算,產(chǎn)生較大誤差。
6. 樣品中的GSSG濃度盡可能低一些,否則反應速率太大,沒法控制,所以稀釋倍數(shù)要盡量大些。
氧化型谷胱/甘肽(GSSG)含量測試盒僅供科研!