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果膠酶（pectinase）試劑盒說明書

                                          微量法100T/48S

注   意 ：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義：

果膠酶（pectinase）是一類分解果膠質酶類的總稱，包括原果膠酶，果膠酯酶，多聚半乳糖醛酸酶和果膠裂解酶四大類，廣泛存在于植物果實和微生物中，主要用于食品、釀酒、環保、醫藥、紡織及日化用品行業。

測定原理：

果膠酶水解果膠生成半乳糖醛酸，具有還原性醛基，與DNS試劑反應生成紅棕色物質，在540nm有特征吸收峰，測定540nm處吸光值變化可計算得果膠酶活性。

自備實驗用品及儀器：

天平、低溫離心機、可見分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板、恒溫水浴鍋。

試劑組成和配制：

提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存。

試劑一：液體20mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：粉劑×2瓶，4℃保存；臨用前加入7.5mL試劑一，50℃加熱溶解，用不完的試劑4℃保存一周。

試劑三：液體20mL×1瓶，4℃避光保存。

酶液提取：

1．組織：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。10000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2．細菌、真菌：按照細胞數量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后10000g，4℃離心10min，取上清置于冰上待測。

3. 細胞培養液等：直接檢測。

測定操作表：

酶活性計算公式：

a.        用微量石英比色皿測定的計算公式如下

標準曲線：y = 3.9642x - 0.008；R² = 0.9996；x為標準品濃度，mg/mL；y為吸光值。

1．按照蛋白濃度計算

酶活性定義：在50℃，pH3.5條件下，每毫克蛋白每小時分解果膠產生1mg半乳糖醛酸為一個酶活力單位。

果膠酶活性（mg/h/mg prot）= (ΔA+0.008) ÷3.9642×V反總÷（V樣×Cpr）÷T

= 2.523×(ΔA+0.008)÷Cpr

2．按照樣本質量計算

酶活性定義：在50℃，pH3.5條件下，每克樣本每小時分解果膠產生1mg半乳糖醛酸為一個酶活力單位。

果膠酶活性（mg/h /g 鮮重）=(ΔA+0.008) ÷3.9642×V反總÷（V樣×W÷V樣總）÷T

= 2.523×(ΔA+0.008)÷W

3. 按細胞數量計算

酶活性定義：在50℃，pH3.5條件下，每10⁴細胞每小時分解果膠產生1mg半乳糖醛酸為一個酶活力單位。

果膠酶活性（mg/h /10⁴cell）=(ΔA+0.008) ÷3.9642×V反總÷（V樣×細胞數量÷V樣總）÷T

= 2.523×(ΔA+0.008)÷細胞數量

4．細胞培養液

酶活性定義：在50℃，pH3.5條件下，每毫升培養液每小時分解果膠產生1mg半乳糖醛酸為一個酶活力單位。

果膠酶活性（mg/h /mL）=(ΔA+0.008) ÷3.9642×V反總÷V樣÷T=2.523×(ΔA+0.008)

V反總：反應總體積，0.15mL；V樣：反應中樣本體積，0.03mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W，樣本質量，g；T：反應時間，0.5h

b.       用96孔板測定的計算公式如下

標準曲線：y = 1.9821x - 0.008，R² = 0.9996；x為標準品濃度，mg/mL；y為吸光值。

1．按照蛋白濃度計算

酶活性定義：在50℃，pH3.5條件下，每毫克蛋白每小時分解果膠產。生1mg半乳糖醛酸為一個酶活力單位。

果膠酶活性（mg/h/mg prot）=(ΔA+0.008) ÷1.9821×V反總÷（V樣×Cpr）÷T

= 5.045×(ΔA+0.008)÷Cpr

2．按照樣本質量計算

酶活性定義：在50℃，pH3.5條件下，每克樣本每小時分解果膠產生1mg半乳糖醛酸為一個酶活力單位。

果膠酶活性（mg/h/g 鮮重）=(ΔA+0.008) ÷1.9821×V反總÷（V樣×W÷V樣總）÷T

= 5.045×(ΔA+0.008)÷W

3. 按細胞數量計算

酶活性定義：在50℃，pH3.5條件下，每10⁴細胞每小時分解果膠產生1mg半乳糖醛酸為一個酶活力單位。

果膠酶活性（mg/h /10⁴cell）=(ΔA+0.008) ÷1.9821×V反總÷（V樣×細胞數量÷V樣總）÷T

= 5.045×(ΔA+0.008)÷細胞數量

4．細胞培養液

酶活性定義：在50℃，pH3.5條件下，每毫升培養液每小時分解果膠產生1mg半乳糖醛酸為一個酶活力單位。

果膠酶活性（mg/h/mL）=(ΔA+0.008) ÷1.9821×V反總÷V樣÷T=5.045×(ΔA+0.008)

V反總：反應總體積，0.15mL；V樣：反應中樣本體積，0.03mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；

W，樣本質量，g；T：反應時間，0.5h

果膠酶（pectinase）試劑盒注意事項：

1.        試劑二若有沉淀析出，請置于50℃加熱溶解。

2.        測定之前請先做預實驗，如果吸光值較高或較低，請用提取液做適當的稀釋或者加大樣本量，并在計算公式中乘以稀釋倍數或者以實際加入的樣本體積參與計算。

3.        煮沸樣本建議在沸水中煮沸10分鐘，以將酶徹di滅活。