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規(guī)格:50管/48樣
丙酮酸脫羧酶( pyruvate decarboxylase,PDC )活性測定試劑盒說明書
紫外分光光度法
注意:正式測定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。
測定意義:
PDC主要存在于酵母中,是乙醇發(fā)酵的關(guān)鍵酶之一,催化丙酮酸脫羧生成乙醛。
測定原理:
PDC催化丙酮酸脫羧生成乙醛,添加乙醇脫氫酶(ADH)來進(jìn)一步催化 NADH還原乙醛生
成乙醇和NAD+;NADH在340nm有吸收峰,而NAD+沒有;通過測定340 nm光吸收下降速率,來計(jì)算PDC活性。
自備儀器和用品:
研缽、冰、臺(tái)式離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)、1mL 石英比色皿、可調(diào)式移液槍和蒸餾水。
試劑組成和配制:
試劑一:液體×1 瓶,4℃保存。
試劑二:液體×1 瓶,4℃保存。
試劑三:液體×1 瓶,4℃保存。
試劑四:粉劑×1 瓶,﹣20℃保存。
試劑五:液體×1 瓶,﹣20℃保存。
混合試劑:臨用前配制,小心把試劑四和五轉(zhuǎn)移到試劑三中,充分溶解。
試劑六:液體×1 瓶,4℃保存。
粗酶液提?。?/span>
1、細(xì)菌或細(xì)胞處理:收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照每200萬細(xì)菌或細(xì)胞加入400μL試劑一,超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(功率200W,工作3s,間歇10s,工作35次),16000g 4℃離心20min,取上清,置冰上待測。
2、組織處理:按照組織質(zhì)量(g):試劑一體積(mL)為 1:5~10 的比例(建議稱取約 0.1g 組
織,加入 1mL 試劑一)進(jìn)行冰浴勻漿,16000g 4℃離心 20min,取上清,置冰上待測。
3、血清(漿)等液體樣品:直接檢測。
PDC 測定操作:
1. 分光光度計(jì)預(yù)熱30min,調(diào)節(jié)波長到340 nm,蒸餾水調(diào)零。
2. 試劑二置于25℃水浴中預(yù)熱30min。
3. 空白管:依次在 1mL 石英比色皿中加入100μL蒸餾水、100μL混合試劑、700μL試劑二
和100μL試劑六,迅速混勻后于340nm比色,記錄15s和75s的吸光值,分別記為 A1 和A2。
4. 測定管:依次在1mL石英比色皿中加入100μL上清液、100μL混合試劑、700μL試劑二
和100μL試劑六,迅速混勻后于340nm 比色,記錄15s和75s的吸光值,分別記為A3和A4。
注意:空白管只需測定一次。
PDC 活性計(jì)算公式:
(1)按照蛋白濃度計(jì)算
活性單位定義:25℃中,每毫克蛋白每分鐘催化 1μmol NADH 氧化為 1 個(gè)酶活單位。
PDC (μmol/min/mg prot) ={[(A3-A4)-(A1-A2)]÷ε÷d×V 總×106 }÷(Cpr×V 樣) ÷T
=1.61×[(A3-A4)-(A1-A2)]÷Cpr
(2)按照樣本質(zhì)量計(jì)算
活性單位定義:25℃中,每克組織每分鐘催化 1μmol NADH 氧化為 1 個(gè)酶活單位。
PDC (μmol/min/g) ={[(A3-A4)-(A1-A2)]÷ε÷d×V 總×106 }÷(W×V 樣÷V 樣總) ÷T
=1.61×[(A3-A4)-(A1-A2)]÷W
(3)按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
活性單位定義:25℃中,每104個(gè)細(xì)胞每分鐘催化1μmol NADH 氧化為 1 個(gè)酶活單位。
PDC (μmol/min/104 cell) ={[(A3-A4)-(A1-A2)]÷ε÷d×V 總×106 }÷(細(xì)胞數(shù)量×V 樣÷V 樣總)÷T=1.61×[(A3-A4)-(A1-A2)]÷細(xì)胞數(shù)量
(4)按血清(漿)體積計(jì)算
活性單位定義:25℃中,每毫升血清(漿)每分鐘催化1μmolNADH 氧化為1個(gè)酶活單位。
PDC (μmol/min /mL) ={[(A3-A4)-(A1-A2)]÷ε÷d×V 總×106 }÷V 樣÷T
=1.61×[(A3-A4)-(A1-A2)]
ε:NADH 摩爾消光系數(shù),6.22×10 3 L/mol/cm;d:比色皿光徑,1cm;V 總:反應(yīng)體系總體
積,1mL=0.001L,V 樣:加入反應(yīng)體系中上清液體積,0.1mL;Cpr:蛋白濃度(mg/mL),需要另外測定,建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量試劑盒;W:樣本質(zhì)量,g ;V 樣總:加入提取液體積,1mL;T:反應(yīng)時(shí)間,1 min。
注意事項(xiàng):
配制好的混合液 3 天內(nèi)使用完。
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