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PCR 引物設計的十個基本原則:
1、引物zuì好在模板 cDNA 的保守區內設計:
DNA 序列的保守區是通過物種間相似序列的比較確定的。搜索不同物種的同一基因,通過序列分析軟件比對,各基因相同的序列就是該基因的保守區。
2、引物長度一般在15~30堿基之間:
引物長度(primer length)常用的是18-27 bp,但不應大于38,因為過長會導致其延伸溫度大于74℃,不適于Taq DNA 聚合酶進行反應。
3、引物 GC 含量在 40%~60% 之間,Tm值zuì好接近 72℃:
上下游引物的 Tm 值是寡核苷酸的解鏈溫度。有效啟動溫度,一般高于 Tm 值 5~10℃,其 Tm 值zuì好接近 72℃ 以使復性條件zuì佳。
4、引物 3′ 端要避開密碼子的第 3 位:
如擴增編碼區域,引物 3′ 端不要終止于密碼子的第 3 位,因密碼子的第 3 位易發生簡并,會影響擴增的特異性與效率。
5、引物 3′ 端不能選擇 A,zuì好選擇 T:
當末位鏈為 T 時,錯配的引發效率大大降低,G、C 錯配的引發效率介于 A、T 之間,所以 3′ 端zuì好選擇 T 。
6、堿基要隨機分布:
降低引物與模板相似性的一種方法是,引物中四種堿基的分布zuì好是隨機的,不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。
7、引物自身及引物之間不應存在互補序列:
引物自身不應存在互補序列,否則引物自身會折疊成發夾結構(Hairpin)使引物本身復性。
8、引物的 5′ 端可以修飾,而 3′ 端不可修飾:
引物 5′ 端修飾包括:加酶切位點;標記生物su、熒光、di高辛、Eu3+等,引物的延伸是從 3′ 端開始的,不能進行任何修飾。
9、擴增產物的單鏈不能形成二級結構:
某些引物無效的主要原因是擴增產物單鏈二級結構的影響,選擇擴增片段時zuì好避開二級結構區域。
10、引物應具有特異性:
引物設計完成以后,應對其進行 BLAST 檢測。如果與其它基因不具有互補性,就可以進行下一步的實驗了。
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