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上海佰利萊生物科技有限公司
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PCR反應過程中的循環參數了解一下

時間:2024/6/27閱讀:250
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循環次數 :一般為25 a~ 30次。循環數決定PCR擴增的產量。模板初始濃度低,可增加循環數以便達到有效的 擴增量。但循環數并不是可以無限增加的。一般循環數為30個左右,循環數超過30個以后,DNA聚合酶活性逐漸達到飽和,產物的量不再隨循環數的增加而增加,出現了所謂的“平臺期"。


循環參數如下:


1.預變性

模板DNA*變性與PCR酶的*激活對PCR能否成功至關重要,建議加熱時間參考試劑說明書,一般未修飾的Taq酶激活時間為兩分鐘。

2.變性步驟

循環中一般95℃,30秒足以使各種靶DNA序列*變性,可能的情況下可縮短該步驟時間。變性時間過長損害酶活性,過短靶序列變性不*,易造成擴增失敗。

3.引物退火

退火溫度需要從多方面去決定,一般根據引物的Tm值為參考,根據擴增的長度適當下調作為退火溫度。然后在此次實驗基礎上做出預估。退火溫度對PCR的特異性有較大影響。

4.引物延伸

引物延伸一般在72℃進行(Taq酶最適溫度)。但在擴增長度較短且退火溫度較高時,本步驟可省略延伸時間隨擴增片段長短而定,一般推薦在1000bp以上,含Pfu及其衍生物的衍生設定為1min/kbp。

5.循環數

大多數PCR含25-35循環,過多易產生非特異擴增。

6.最后延伸

在最后一個循環后,反應在72℃維持10-30分鐘.使引物延伸*,并使單鏈產物退火成雙鏈。


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