RIP技術(shù)(RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀)
RIP技術(shù)(RNA Binding Protein Immunoprecipitation,RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀),是研究細胞內(nèi)RNA與蛋白結(jié)合情況的技術(shù)。分析與目的蛋白結(jié)合的RNA.運用針對目標蛋白的抗體把相應(yīng)的RNA-蛋白復合物沉淀下來,然后經(jīng)過分離純化就可以對結(jié)合在復合物上的RNA進行分析;即用抗體或表位標記物捕獲細胞核內(nèi)或細胞質(zhì)中內(nèi)源性的RNA結(jié)合蛋白,防止非特異性的RNA的結(jié)合,免疫沉淀把RNA結(jié)合蛋白及其結(jié)合的RNA一起分離出來,結(jié)合的RNA序列可通過microarray(RIP-Chip),定量RT-PCR或 高通量測序(RIP-Seq)方法來鑒定。是了解轉(zhuǎn)錄后調(diào)控網(wǎng)絡(luò)動態(tài)過程的有力工具,能幫助我們發(fā)現(xiàn)miRNA的調(diào)節(jié)靶點。
RIP實驗流程
(一). 細胞裂解液獲取
A. 單層細胞或者貼壁細胞處理
1. 冷PBS清洗培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中的細胞兩次
2. 加入冷PBS后用細胞刮將細胞刮下來,收集至enpendoff管
3. 1500rpm,4℃離心5min,棄上清,收集細胞
4. 用與細胞等體積的RIP裂解液重懸細胞,吹打均勻后于冰上靜置5min
5. 每管分裝200ul細胞裂解液,貯存于-80℃
B. 懸浮細胞處理:先收集細胞再計數(shù),然后清洗裂解
C. 組織樣品處理
1.冷PBS清洗新鮮切下的組織三次
2. 加入冷PBS后,用勻漿器或其他細胞分離設(shè)備使組織分散為單個細胞,計數(shù)
3. 1500rpm,4℃離心5min,棄上清,收集細胞
4. 用與細胞等體積的RIP裂解液重懸細胞,吹打均勻后置于冰上靜置5min
5. 每管分裝200ul細胞裂解液,貯存于-80℃
(二). 磁珠的準備
A. 實驗前準備
1、enpendoff管
2、磁力架
3、冰盒, RIP Wash Buffer置于冰上
4、抗體,置于冰上
5、渦旋震蕩器
6、槍、槍頭放于超凈臺照射30min,槍噴DEPC水
B. 磁珠準備過程
1. 重懸磁珠
2. 標記實驗所需的enpendoff管,樣品包括目的樣品,陰性對照與陽性對照
3. 吸取50ul 重懸后的磁珠懸液于每個enpendoff管
4. 每管加入500ul RIP Wash Buffer,渦旋震蕩
5.將enpendoff管置于磁力架上,并左右轉(zhuǎn)動15°使磁珠吸附成一條直線,去上清,重復一次
6.用100ul的RIP Wash Buffer重懸磁珠,加入約5ug相應(yīng)抗體于每個樣品中
7. 室溫孵育30min
8. 將enpendoff管置于磁力架上,棄上清
9. 加入500ul RIP Wash Buffer,渦旋震蕩后棄上清,重復一次
10. 加入500ul RIP Wash Buffer,渦旋震蕩后置于冰上
(三). RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀
A. 準備工作
1、冰盒
2、360°旋轉(zhuǎn)儀
3、RIP Wash Buffer 、0.5M EDTA 、RNase Inhibitor 置于冰上
B. RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀實驗過程
1.準備RIP Immunoprecipitation Buffer
2.將前上步的enpendoff管放磁力架上,去上清,每管加入900ul RIP Immunoprecipitation Buffer
3. 迅速解凍*步制備的細胞裂解液,14,000rpm,4℃離心10min。吸取100ul上清液于上一步的磁珠-抗體復合物中,使得總體積為1ml
4. 4℃孵育3h至過夜
5. 短暫離心,將enpendoff管放在磁力架上,棄上清
6. 加入500ul RIP Wash Buffer,渦旋震蕩后將enpendoff管放在磁力架上,棄上清,重復清洗6次
(四). RNA純化
A. 實驗前準備
1.槍、槍頭、enpendoff管紫外照射30min,噴DEPC水以除RNA酶
2. Salt SolutionⅠ、Salt SolutionⅡ、RIP Wash Buffer、Proteinase K、10%SDS、 Precipitate Enhancer 置于冰上
3.RNase-free的乙醇、(lv)仿、異戊醇
4.DEPC水置于冰上
5. 離心機預冷
6. 冰盒
B. RNA純化過程
1.準備Proteinase K Buffer。每個樣品需150ul
2.用150ul Proteinase K Buffer重懸上述磁珠-抗體復合物
3. 55℃孵育30min
4. 孵育完之后,將enpendoff管置于磁力架上,將上清液吸入一新的enpendoff管中
5. 于每管上清液中加入250ulRIP Wash Buffer
6. 于每管加入400ul苯酚:(lv)仿:異戊醇,渦旋震蕩15s,室溫下14,000rpm離心10min
7. 小心的吸取350ul上層水相,吸入另一新的enpendoff管
8. 于每管加入400ul(lv)仿,渦旋震蕩15s,室溫下14,000rpm離心10min
9. 小心的吸取300ul上層水相,吸入另一新的enpendoff管
10. 每管加入50ul Salt SolutionⅠ,15ul Salt SolutionⅡ,5ul Precipitate Enhancer ,850ul 無水乙醇(無RNase),混合,-80℃保持1h至過夜
11. 14,000rpm,4℃離心30min,小心去上清
12. 用80%乙醇沖洗一次,14,000rpm,4℃離心15min,小心去上清,空氣中晾干.
13. 10-20ul DEPC水溶解,-80℃保存,送測序或進行下游實驗。
收費標準/服務(wù)周期/提供結(jié)果:
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