酵母質粒提取試劑盒

產品貨號：26220

產品規格：50T/100T

產品簡介：

試劑盒采用酶法破碎酵母細胞壁和堿裂解法裂解酵母細胞來提取酵母質粒DNA。所采用的酵母破壁酶能有效地破壞酵母細胞壁，提高酵母質粒DNA的產量。吸附柱中采用的硅基質材料能高效、專一地吸附DNA，可最大限度去除雜質蛋白質及細胞中其他有機化合物。使用本試劑盒提取的酵母質粒DNA可適用于各種常規的分子生物學實驗，包括酶切、PCR、測序、連接和轉化等試驗。本試劑盒無需使用酚、氯仿等有毒試劑，操作安全。

產品組成：

注意：使用前請先在漂洗液中加入無水乙醇，加入體積請參照瓶體上的標簽。YP1在使用前先加入RNaseA （將

試劑盒中提供的RNaseA全部加入），混勻，置于2-8 ℃保存。如非指明，所有離心步驟均為使用臺式離心機在

室溫下離心。

操作步驟：

1. 取1-5ml酵母培養物（不超過5×10 ⁷ cells），12000rpm離心1min，盡量吸除上清（菌液較多時可以通過多次離心將菌體沉淀收集到一個離心管中）。

2. 酵母細胞壁的破除：

A、酶法：向酵母菌體中加入470ul山梨醇Buffer，充分懸浮菌體，加入25ul酵母破壁酶和5ul巰基還原劑，

充分混勻，30℃處理1-2h，期間可顛倒離心管混勻數次。12000rpm離心1min，棄上清，收集沉淀。向沉淀中加入250ulYP1（請先檢查是否已加入RNaseA），充分懸浮沉淀。注意：如果菌塊未*混勻，會影響裂解導致質粒提取量和純度偏低。

B、玻璃珠法：向酵母菌體中加入250ul YP1（請先檢查是否已加入RNaseA），充分懸浮沉淀。加入150-200ul

酸洗玻璃珠（自備），漩渦振蕩10min。簡短離心使玻璃珠沉降到離心管底，吸取上清（如上清有所損失，請用YP1補足至250ul）于另一干凈離心管中。

3. 向離心管中加入250ul YP2，溫和地上下翻轉6-8次使菌體充分裂解。注意：混勻一定要溫和，以免污染細菌基因組DNA，此時菌液應變得清亮粘稠，作用時間不要超過5 min，以免質粒受到破壞。

4. 向離心管中加入350ul YP3，立即溫和地上下翻轉6-8次，充分混勻，此時會出現白色絮狀沉淀。12000rpm離心10 min，用移液器小心地將上清轉移到另一個干凈的離心管中，盡量不要吸出沉淀。注意：YP3加入后應立即混合，避免產生局部沉淀。如果上清中還有微小白色沉淀，可再次離心后取上清。

5. 將上一步所得上清液加入吸附柱中，室溫放置2min，12000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

6. 向吸附柱中加入600ul漂洗液( 使用前請先檢查是否已加入無水乙醇)，12000rpm離心1min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。

7. 向吸附柱中加入600ul漂洗液，12000rpm離心1min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。

8. 12000rpm離心2min，將吸附柱敞口置于室溫或50℃溫箱放置數分鐘，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，

否則漂洗液中的乙醇會影響后續的實驗如酶切、PCR等。

9. 將吸附柱放入一個干凈的離心管中，向吸附膜中央懸空滴加50-200ul經65℃水浴預熱的洗脫液，室溫放置 2min，12000rpm離心1min。

10. 為了增加質粒的回收效率，可將得到的洗脫液重新加入吸附柱中，室溫放置2min，12000rpm離心1min。

注意事項：

1. 使用前請先檢查YP2和YP3是否出現混濁，如有混濁現象，可在37℃水浴中加熱幾分鐘，待溶液恢復澄清后再使用。

2. 洗脫緩沖液體積不應少于50ul，體積過小影響回收效率；洗脫液的pH值對洗脫效率也有影響，若需要用水做洗脫液應保證其pH值在8.0左右(可用NaOH將水的pH值調至此范圍)，pH值低于7.0會降低洗脫效率；DNA產物應保存在-20℃，以防DNA降解。

3. 質粒得率與酵母菌株、質粒拷貝數、培養條件等因素有關。通常酵母質粒拷貝數都很低，一般通過電泳或分光光度計法都很難檢測到，可通過PCR或轉化大腸桿菌來檢測。

4. DNA濃度及純度檢測：得到的基因組DNA片段的大小與樣品保存時間、操作過程中的剪切力等因素有關。

回收得到的DNA片段可用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測濃度與純度。DNA應在OD ₂₆₀處有顯著吸收峰，OD ₂₆₀ 值為1相當于大約50μg/ml 雙鏈DNA、40μg/ml單鏈DNA。OD ₂₆₀ /OD ₂₈₀ 比值應為1.7-1.9，如果洗脫時不使用洗脫緩沖液，而使用去離子水，比值會偏低，因為pH值和離子存在會影響光吸收值，但并不表示純度低。

保存條件：

室溫（15-25℃）干燥保存，復檢期為12個月。2-8℃保存時間更長。