產品貨號：10259

 產品規格：50T/100T 

產品簡介： 

線粒體是細胞呼吸的主要場所，細胞活動所需的能量主要由在線粒體內進行的氧化所產生的能量來供應。制備線粒體的關鍵是保持線粒體的完整性和純度，可通過分級分離法獲得，即先低俗出去細胞核以及細胞碎片，再進行高速梯度離心分離線粒體。尚寶生物 硬組織線粒體分離試劑盒(Hard Tissue Mitochondria Isolation Kit)是快速便捷分離動物硬組織(如骨骼肌)中的線粒體的試劑盒，分離線粒體的同時可以獲得去除線粒體的細胞漿蛋白，可用于分析細胞色素C等線粒體蛋白向胞漿的釋放，大部分獲得的線粒體都含有完整的內膜和外膜，并具有線粒體的生理功能(如檢測線粒體膜電位)，獲得的蛋白可用于SDS-PAGE、Western、雙向電泳等蛋白分析。該試劑盒適用于從動物硬組織(心肌、骨骼肌)或其他難以分離線粒體的組織中提取線粒體。該試劑盒僅用于科研領域，不宜用于臨床診斷或其他用途。產品組成：試劑名稱 50T 100T 保存條件試劑(A): Wash buffer 100ml 200ml -20℃試劑(B): Mitochondria Lysis buffer 50ml 100ml -20℃試劑(C): Mitochondria Stock buffer 50ml 100ml -20℃試劑(D): Protein Stock buffer (5×) 10ml 20ml 室溫試劑(E): PMSF(100×) 1.5ml 3ml -20℃ 

自備材料： 

1. 低溫離心機、勻漿器

2. 尼龍網或細胞篩 

操作步驟 (僅供參考) ： 

1. 清洗：動物禁食 24h 后處死，取新鮮橫紋肌等組織，迅速稱重 50～100mg，用預冷的 Wash buffer 清洗 2 次，棄 Wash buffer，冰上剪成 30mm 大小的組織碎片。

2. 裂解：加入 10 倍體積的預冷的 Mitochondria Lysis buffer，置于冰浴 5～10min。

 3. 勻漿Ⅰ：轉移至預冷的 Dounce 勻漿器中，勻漿 10～20 次，或采用電動勻漿器，700rpm，8～10 次。不同組織或不同勻漿器所需的勻漿次數有所不同，需自行優化。

 4. 勻漿Ⅱ：4℃攪拌孵育 5～10min。用等體積的 Mitochondria Stock buffer 秲釋至勻漿液，再次重復步驟 3。

 5. 離心：用尼龍網或細胞篩過濾勻漿液，4℃，1000g 離心 15min，重復 1 次，以去除細胞核、未破碎的細胞和大的膜碎片。注：如需獲得純度更高的線粒體，可以將此步驟的離心速度改為 2000g 離心 10min，其缺點是相同數量細胞的線粒體抽提得率會下降。 

6. 上清液轉移至一干凈離心管，4℃ 12000g 離心 10min。

注：如需獲得純度更高的線粒體，可以將此步驟的離心速度改為 6000g 離心 10min，其缺點是相同數量細胞的線粒體抽提得率會下降。

 7. 棄上清，沉淀為線粒體，如果希望獲得去除線粒體的細胞漿蛋白，應在本步驟中收集上清，并且在收集上清時注意勿觸及沉淀。隨后把收集的上清 12000g，4℃離心 10min，上清即為去除線粒體的細胞漿蛋白。 

8. 保存：棄上清，用適當緩沖液懸浮沉淀。如果用于線粒體酶活性或功能的分析，線粒體沉淀應重懸于Mitochondria Stock buffer；如果用于線粒體蛋白的分析，獲得的細胞漿蛋白應保存于 1×Protein Stock buffer，即按細胞漿蛋白：Protein Stock buffer (5×)=1:4 比例混合；如果用于雙向電泳，應使用恰當的保存液。 

注意事項：

 1. 試劑 (如 PMSF)對于不同實驗不必全部使用，在實驗條件成熟后可以不必使用。

 2. 如果不是用于制備線粒體蛋白，Mitochondria Lysis buffer 和 Mitochondria Stock buffer 不必加入 PMSF。如果用于制備線粒體蛋白樣品，Mitochondria Lysis buffer 和 Mitochondria Stock buffer 需添加 PMSF。PMSF 一定要在試劑加入到樣品中前 1～2min 內加入，以免 PMSF 在水溶液中很快失效。

 3. 分離線粒體的所有步驟均需在冰上或 4℃進行，所用溶液需冰浴或 4℃預冷，全部操作時間盡量控制在 1h 以內。

 4. 通常在分離線粒體時前后兩次離心速度選取 1000g 和 12000g，如果希望純度更高，但對線粒體的得率要求不高，前后兩次離心速度可用 2000g 和 6000g。 

有效期：12 個月有效。