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BA18003
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100次 1580元 999盒 可售
更新時(shí)間:2022-03-09 16:08:48瀏覽次數(shù):325次
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貨號(hào) | BA18003 | 應(yīng)用領(lǐng)域 | 化工,生物產(chǎn)業(yè) |
G6P檢測(cè)試劑盒(WST-8法)
產(chǎn)品貨號(hào):BA18003
產(chǎn)品規(guī)格:100次
產(chǎn)品簡(jiǎn)介:
尚寶的G6P檢測(cè)試劑盒(WST-8法) (G6P Assay Kit with WST-8)是一種高靈敏度的基于WST-8的顯色反應(yīng),通過(guò)比色法來(lái)檢測(cè)細(xì)胞、組織或其它樣品中G6P含量的檢測(cè)試劑盒。 ?
WST-8是MTT的一種升級(jí)替代產(chǎn)品,和MTT或其他MTT類(lèi)似產(chǎn)品如XTT、MTS等相比有明顯的優(yōu)點(diǎn)。首先,MTT被一些脫氫酶還原生成的formazan不是水溶性的,需要有特定的溶解液來(lái)溶解;而WST-8和XTT、MTS產(chǎn)生的formazan都是水溶性的,可以省去后續(xù)的溶解步驟。其次,WST-8產(chǎn)生的formazan比XTT和MTS產(chǎn)生的formazan更易溶解。再次,WST-8比XTT和MTS更加穩(wěn)定,使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加穩(wěn)定。另外,WST-8和MTT、XTT等相比,線性范圍更寬,靈敏度更高。WST-8和WST-1相比,檢測(cè)靈敏度更高,更易溶解,并且更加穩(wěn)定。 ?
本試劑盒使用便捷。使用細(xì)胞、組織等的裂解液即可進(jìn)行檢測(cè),無(wú)需分離純化細(xì)胞、組織或其它樣品中的G6P。 ? 本試劑盒檢測(cè)靈敏度高,線性范圍寬??梢詸z測(cè)含量低至20μM (1nmol)的G6P,在20μM (1nmol)至500μM (25nmol)之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。 ?
G6P (Glucose-6-phosphate,葡萄糖-6-磷酸,又稱(chēng)6-磷酸葡萄糖)是葡萄糖的第6位碳上的羥基在己糖激酶催化下發(fā)生磷酸化后生成的分子,是細(xì)胞中常見(jiàn)的糖代謝小分子,參與糖酵解(glycolytic pathway)和磷酸戊糖(pentose phosphate pathway)等生化途徑。在糖酵解的第一步反應(yīng)中,葡萄糖被己糖激酶催化生成葡萄糖-6-磷酸,然后通過(guò)磷酸葡萄糖異構(gòu)酶的催化形成果糖-6-磷酸,以繼續(xù)糖酵解的其它步驟;而在戊糖磷酸途徑中,葡萄糖-6-磷酸是其第一個(gè)底物,該過(guò)程也是生成NADPH的主要途徑。除了這兩個(gè)代謝途徑外,葡萄糖-6-磷酸也能轉(zhuǎn)化形成糖原或淀粉而被存儲(chǔ)起來(lái)。 ?
本試劑盒可檢測(cè)樣品中的G6P含量,具體原理如下:葡萄糖-6-磷酸(G6P)在葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase, G6PDH)的作用下氧化生成6-磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯(6-phosphogluconate, 6-PG),在這一反應(yīng)中NADP+ 被還原為NADPH,生成的NADPH在電子耦合試劑1-mPMS (1-Methoxy-5-methylphenazinium Methyl Sulfate)的作用下將WST-8還生成橙黃色的formazan,在450nm左右有最大吸收峰。反應(yīng)體系中生成的formazan與樣品中總的G6P的量呈正比關(guān)系。 WST-8法檢測(cè)G6P的原理參考圖1。
本試劑盒適用于檢測(cè)細(xì)胞、組織以及其它適當(dāng)樣品中G6P的含量。 ?
本試劑盒可以測(cè)定100個(gè)樣品。
產(chǎn)品組成:
產(chǎn)品名稱(chēng) | 100次 |
酶混合液 | 220μl |
G6P標(biāo)準(zhǔn)品(10mM) | 100μl |
顯色液 | 220μl |
反應(yīng)緩沖液 | 5.5ml |
G6P提取液 | 50ml |
使用說(shuō)明:
1. 樣品的準(zhǔn)備:
a. G6P提取液室溫或37oC水浴解凍,解凍后置于冰浴。如果37℃水浴解凍,須注意解凍后立即置于冰浴。
b. 細(xì)胞樣品的準(zhǔn)備:對(duì)于貼壁細(xì)胞,約1×106個(gè)細(xì)胞(大約相當(dāng)于6孔板一個(gè)孔長(zhǎng)滿的細(xì)胞數(shù)量),吸凈培養(yǎng)液,用移液器加入200μl的冰浴預(yù)冷的G6P提取液,并輕輕吹打,以促進(jìn)細(xì)胞的裂解;對(duì)于懸浮細(xì)胞,收集約1×106個(gè)細(xì)胞,600g離心5分鐘,吸凈培養(yǎng)液,用移液器加入200μl冰浴預(yù)冷的G6P提取液,并輕輕吹打,以促進(jìn)細(xì)胞的裂解。裂解過(guò)程宜盡量在冰上操作。隨后12,000g,4℃離心5-10分鐘,取上清作為待測(cè)樣品,冰浴存放備用。
c. 組織樣品的準(zhǔn)備:冰浴預(yù)冷的PBS洗滌組織后,稱(chēng)取約10-50mg的組織樣品,用剪刀剪碎,置于勻漿器中,加入400μl的冰浴預(yù)冷的G6P提取液在冰上或室溫進(jìn)行勻漿。隨后12,000g,4oC離心5-10分鐘,取上清作為待測(cè)樣品,冰浴存放備用。注:勻漿過(guò)程在冰上或室溫操作均可,但以冰浴操作為佳,可以有效減少內(nèi)源性G6P水平的下降。
d. 液體樣品可以直接進(jìn)行檢測(cè)。
注意:如果樣品中存在能轉(zhuǎn)變或消耗G6P的酶,在檢測(cè)前需使用10kDa超濾管去掉蛋白質(zhì)以避免酶的影響。
2. 試劑盒的準(zhǔn)備工作:
a. G6P標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備:把10mM的G6P標(biāo)準(zhǔn)品用G6P提取液稀釋成適當(dāng)?shù)臐舛忍荻?。如初次檢測(cè)可以設(shè)置0、31.25、62.5、125、250、500μM這幾個(gè)濃度,檢測(cè)時(shí)96孔板每孔加入50μl的標(biāo)準(zhǔn)品,相當(dāng)于每孔加入的G6P的量為0、1.56、3.125、6.25、12.5、25nmol。如有必要,在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中可以根據(jù)樣品中的G6P含量對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度范圍進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。其中濃度為0μM的點(diǎn)為空白對(duì)照點(diǎn)(Blank),僅含G6P提取液。
b. G6P檢測(cè)液的配制:樣品中的NADPH等可能會(huì)產(chǎn)生一定的背景,建議設(shè)置加入樣品而不加入酶混合液的背景對(duì)照;對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的G6P檢測(cè)液,需要加入酶混合液。每個(gè)背景對(duì)照、標(biāo)準(zhǔn)品或樣品的檢測(cè)需要使用50μl的G6P檢測(cè)液,請(qǐng)根據(jù)所需檢測(cè)的背景對(duì)照、標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的數(shù)量,配制適量的G6P檢測(cè)液,并注意現(xiàn)配現(xiàn)用。G6P檢測(cè)液的配制方法如下:
G6P檢測(cè)液(背景對(duì)照) | G6P檢測(cè)液(標(biāo)準(zhǔn)品或樣品) | |
反應(yīng)緩沖液 | 48μl | 46μl |
顯色液 | 2μl | 2μl |
酶混合液 | - | 2μl |
3. 樣品測(cè)定:
a. 樣品中G6P含量的測(cè)定:吸取50μl待測(cè)樣品至96孔板中,為了減少實(shí)驗(yàn)建議設(shè)置樣品的重復(fù)孔。后續(xù)如果發(fā)現(xiàn)樣品中的G6P含量過(guò)高,超出標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍,則需要用G6P提取液將樣品適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行檢測(cè);含量過(guò)低時(shí)則需要 加大細(xì)胞或組織樣品的用量。
b. 每孔加入50μl G6P檢測(cè)液,用移液槍輕輕吹打均勻。在加入G6P檢測(cè)液的過(guò)程中須輕柔操作,以免產(chǎn)生氣泡。若不慎出現(xiàn)氣泡,可使用細(xì)小的吸頭或針頭戳破。背景對(duì)照孔需要加入50μl不含G6P底物的G6P檢測(cè)工作液。特別注意:如果樣品中的NADPH等產(chǎn)生的背景比較高,就必須設(shè)置背景對(duì)照;初次檢測(cè)宜設(shè)置背景對(duì)照。
c. 37℃避光孵育10分鐘,此時(shí)會(huì)形成橙黃色的formazan。測(cè)量450nm處的吸光度,如果顯色較淺,也可以適當(dāng)延長(zhǎng)孵育時(shí)間至15-30分鐘,隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)顯色會(huì)越來(lái)越深。
4. 樣品中G6P含量的計(jì)算:
a. 將標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的吸光度減去標(biāo)準(zhǔn)品濃度為0μM的空白對(duì)照(Blank)吸光度。同時(shí),如果背景對(duì)照(Background)的吸光度比較高,需要再將所有樣品的吸光度減去各自的背景對(duì)照的吸光度。
b. 以G6P濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。G6P標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)效果請(qǐng)參考圖2。
圖2. 本試劑盒檢測(cè)G6P的標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖中的反應(yīng)時(shí)間為30分鐘。不同的檢測(cè)條件下,實(shí)際讀數(shù)會(huì)因標(biāo)準(zhǔn)品的配制、檢測(cè)儀器等的不同而存在差異,圖中數(shù)據(jù)僅供參考。
c. 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算細(xì)胞、組織等樣品中的G6P濃度。
備注:根據(jù)檢測(cè)得到的濃度及樣品的體積,即可計(jì)算出G6P的量。
d. 如果希望更加精確地來(lái)表述G6P的量,可以將樣品用BCA法測(cè)定蛋白濃度。最終用單位蛋白量中G6P的量來(lái)比較精確地進(jìn)行表述。
注意事項(xiàng):
1. 經(jīng)檢測(cè)本試劑盒中的酶混合液室溫存放72小時(shí)或反復(fù)凍融5次不影響其酶活性。 ?
2. 由于G6P提取液略顯粘稠,以該提取液作為稀釋液時(shí),無(wú)論對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品還是樣品進(jìn)行稀釋?zhuān)谙♂屵^(guò)程中務(wù)必確保稀釋均勻,否則易造成實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)產(chǎn)生較大波動(dòng)。 ?
3. 在樣品加樣和混勻過(guò)程中,須盡量避免產(chǎn)生氣泡,以免影響最終的吸光度測(cè)定。 ?
4. 如果不能非常嚴(yán)格地控制反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間,每次檢測(cè)都需要設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)曲線。 ?
5. 如果樣品溶液中G6P濃度過(guò)高或過(guò)低,不在試劑盒的線性檢測(cè)范圍內(nèi)時(shí),可適當(dāng)調(diào)整樣品或者提取液的用量。 ?
6. 盡量使用新鮮樣品進(jìn)行檢測(cè),凍存或反復(fù)凍融的細(xì)胞或組織樣品可能對(duì)結(jié)果有一定影響。 ?
7. 本產(chǎn)品僅限于專(zhuān)業(yè)人員的科學(xué)研究用,不得用于臨床診斷或治療,不得用于食品或藥品,不得存放于普通住宅內(nèi)。
8. 為了您的安全和健康,請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
保存條件:-20oC保存,一年有效。顯色液須-20oC避光保存。
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