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qPCR中的絕對定量是什么？2021/10/14
絕對定量目的是使用PCR測定目的基因在樣本中的數量，即拷貝數。在絕對定量中，想要得到目的基因的拷貝數，需要制作標準曲線圖。制作標準曲線圖需要將標準品稀釋至不同濃度，作為模板進行PCR。標準品是已知濃度...
qPCR中的相對定量是什么？2021/10/14
相對定量常用于測定兩個不同樣品中靶基因量的差異，例如使用實時RT-PCR法定量檢測mRNA水平的實驗。進行相對定量實驗分析兩個不同樣品的實驗數據時，需要對數據進行歸一化處理，設置其中一個樣品的靶基因表...
什么是多重PCR？2021/10/14
多重PCR反應是指在單次PCR反應中同時擴增一種以上的靶基因。現有多種熒光染料可使用，使得運行多重實時熒光PCR成為可能。如能同時檢測薪冠、甲流、乙流的核酸檢測試劑盒，實驗原理就是多重PCR。常見的熒...
實時熒光定量PCR的優化（六）2021/10/14
引物和探針的濃度也需要尋找*濃度，這通常憑借經驗決定。為什么要尋找*濃度呢？因為像Taqman探針在反應過程中會被破壞，需要在起始濃度便保留足量的探針。這個濃度通常是在反應體系中達到250nmol/L...
實時熒光定量PCR的優化（五）2021/10/12
想要提高探針的的效果，可以考慮在探針上采用LNA（鎖核酸）堿基或MGB（小溝結合劑）基團。這樣做的效果是：1、增強探針與靶序列的雜交強度。增強結合的特異性后，背景噪聲降低，從而提高整個實驗的靈敏度。2...
實時熒光定量PCR的優化（四）2021/10/12
這期我們來學習設計TaqMan探針，應該考慮的因素有以下這些......1、TaqMan探針的最佳長度在20bp，不超過30bp，這樣才能實現熒光淬滅。有些情況下超過30bp也是可以的，需要將淬滅基團...
實時熒光定量PCR的優化（三）2021/10/12
本期介紹設計引物，得到實時熒光PCR引物對，這種方法也可以用于普通PCR。1、長度應該在18～30bp，保證結合的特異性。2、熔解溫度（Tm值）應在55～60°C，兩條引物的Tm值應相差2～3°C。3...
實時熒光定量PCR的優化（二）2021/10/12
如果你所研究的靶序列有前人建立過實時熒光定量PCR的方法，就可以在公共數據庫中查找，查看擴增效率、特異性、靈敏度等信息，省去從頭開始的時間。注意，使用前人建立的方法前，需要再次驗證這個方法的參數是不是...
實時熒光定量PCR的優化（一）2021/10/12
如果是病毒定量和SNP基因分型的實時熒光定量PCR，我們需要盡可能高特異性；如果是病原體、mRNA檢測，我們需要高靈敏度。想要提高PCR擴增效率、特異性及靈敏度，我們可以通過一系列措施優化實時熒光定量...
qPCR實驗為什么要制作熔解曲線？2021/10/11
熒光DNA結合染料法的缺點是它們能在反應中結合所有DNA雙鏈，包括在實時熒光PCR中產生的引物二聚體，和其他非特異性產物，引起大量的背景噪聲信號。這種噪聲會影響我們對靶基因產量的評估，甚至熒光強度和靶...
經濟快捷的SNP位點研究方法-SNP基因分型2021/10/11
SNP，全稱SingleNucleotidePolymorphisms，是指在基因組上單個核苷酸的變異。目前很多人仍然使用測序法來進行研究，具有準確、直觀的優點。但有一種方法，能間接的研究SNP，且經...
生化轉染的另一種選擇，磷酸鈣介導的轉染2021/10/11
磷酸鈣介導的轉染方法應用于將外源DNA轉入培養的細胞，已有45年以上的歷史。Graham和vanderEb在磷酸鈣存在下，將病毒DNA導入哺乳動物細胞的這一工作，為基因在多種哺乳動物細胞中進行瞬時表達...
共轉化，篩選轉染細胞的實用工具2021/10/11
想要達到轉染的目的，即分析轉染基因的功能和表達，需要轉染的基因穩定整合進入宿主染色體。根據細胞類型，細胞群體中，最高有80%的細胞，以瞬時表達的方式表達轉染的基因。但對于穩定轉染，好的情況，也只有1/...
如何提高磷酸鈣轉染的效率？2021/10/11
提高磷酸鈣轉染法效率的共通步驟，目的都是為了避免產生會被細胞內吞、加工失效的大顆粒沉淀。提高轉染效率的操作有以下這些：1、將小分子DNA整合在高分子質量基因組DNA上，以大分子作為運載體，能提高轉染效...
怎么提高電穿孔法轉染的效率？2021/10/9
電穿孔法難點在于提高電穿孔的效率。實驗操作者一般能從電轉儀廠家得到轉染的詳細方案和優化指導。當你需要自己優化轉染效率時，可以從以下方面進行：1、外加電場的強度：電壓過低，細胞膜不能形成小孔，使得外源分...
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